鄭大郭鐘偉/清華大學(xué)孫偉教授合作Biofabrication | 凝聚作用觸發(fā)的分層組裝水凝膠...

粘附性水凝膠作為組織粘合劑、外科密封劑和止血材料具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，開(kāi)發(fā)能夠在潮濕、動(dòng)態(tài)的生物組織上快速可控發(fā)揮粘附作用的水凝膠材料是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。近日，一篇名為“Coacervation-triggered hierarchically assembled hydrogels with application as surgical sealant”的文章由鄭州大學(xué)郭鐘偉副研究員和清華大學(xué)孫偉教授等在Biofabrication (IF=11.06)上發(fā)表。研究開(kāi)發(fā)了一種凝聚作用觸發(fā)的成型策略，使重組人膠原蛋白（RHC）和單寧酸（TA）能夠進(jìn)行分層組裝，該策略制備的水凝膠具有作為手術(shù)密封材料的多種優(yōu)良性能，包括快速凝膠時(shí)間(<10s)、凝血時(shí)間(<60s)、超拉伸性(應(yīng)變>10000%)、強(qiáng)粘附力(粘附強(qiáng)度>250 kPa)。最后成功應(yīng)用于心臟和肝臟組織的牢固粘附和密封。這項(xiàng)工作為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了一種在潮濕和動(dòng)態(tài)生物環(huán)境中極具前景的水凝膠基外科密封劑。

技術(shù)路線

圖1. 基于RHC和TA分子凝聚作用的快速交聯(lián)、高粘附、超拉伸、止血水凝膠的設(shè)計(jì)策略。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2. 基于分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法預(yù)測(cè)RHC與TA分子的相互作用。

在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，作者首先利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法來(lái)證明RHC和TA可能通過(guò)物理相互作用形成組裝復(fù)合體的假設(shè)（圖2）。通過(guò)分子建模的方法構(gòu)建RHC與TA分子的三維結(jié)構(gòu)，并通過(guò)GROMACS進(jìn)行優(yōu)化，隨后將二者在進(jìn)行混合，結(jié)果顯示RHC和TA分子在整個(gè)20 ns過(guò)程中緊密結(jié)合而沒(méi)有分離，表明它們之間有很強(qiáng)的相互作用。

圖3. RHC與TA分子相互作用的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

為了驗(yàn)證分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果的準(zhǔn)確性，作者設(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證明（圖3）。RHC和TA溶液在混合前均保持透明的溶液狀態(tài)，隨著二者的混合，溶液逐漸變成乳白色并有沉淀緩慢形成。通過(guò)SEM分析，結(jié)果顯示RHC在混合步驟前表現(xiàn)出松散的顆粒結(jié)構(gòu)，而TA分子的摻入使得RHC形成致密的塊狀結(jié)構(gòu)。UV-vis結(jié)果顯示，在加入RHC后，TA分子在280 nm處的特征吸收峰明顯可見(jiàn)，并保持不變，說(shuō)明苯酚基沒(méi)有被氧化。不同組成的混合物的FT-IR光譜所示，隨著TA的摻入，吸收峰明顯降低，這可能與RHC與TA之間的氫鍵作用有關(guān)。

圖4. RHC-TA水凝膠的合成與表征。

通過(guò)調(diào)節(jié)RHC與TA的濃度，RHC與TA可形成微黃色水凝膠（圖４）。作者隨后進(jìn)行了一系列的液態(tài)-凝膠態(tài)相變實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，凝聚復(fù)合體可從液體（灰色區(qū)域）、顆粒狀聚集（綠色區(qū)域）到網(wǎng)狀聚集（松散、黃色區(qū)域）和網(wǎng)狀聚集（密集、紅色區(qū)域）發(fā)生遞進(jìn)轉(zhuǎn)變，最多有四個(gè)組裝階段。利用熒光顯微鏡描述了通過(guò)過(guò)渡階段的形態(tài)變化，顆粒狀聚集體呈隨機(jī)分散的塊狀角結(jié)構(gòu)。

圖５. RHC-TA水凝膠的流變、可塑性、可變形、自愈合特性。

如圖５顯示，RHC-TA水凝膠具有非常優(yōu)越的“液－固”粘彈性特征，一塊球形RHC-TA水凝膠可以被加工成各種形狀，包括球形、立方體、三角形、矩形、花朵、房屋等。

圖６. RHC-TA水凝膠的力學(xué)特征。

得益于動(dòng)態(tài)和可逆的物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，RHC-TA水凝膠表現(xiàn)出了優(yōu)異的機(jī)械性能（圖6）。比如超可拉伸性能。由于高加工性和靈活性，拉伸的燈絲可以像普通線一樣繞著收集桿旋轉(zhuǎn)，成功制作了500、300和150μm不同直徑的直線細(xì)絲。當(dāng)拉伸水凝膠時(shí)，RHC和TA之間的動(dòng)態(tài)和可逆的物理相互作用通過(guò)解壓縮分層纖維結(jié)構(gòu)的交聯(lián)點(diǎn)，提供了一個(gè)有效的能量耗散函數(shù)。通過(guò)拉伸和壓縮試驗(yàn)得到的應(yīng)力-應(yīng)變曲線所示，RHC-TA水凝膠具有良好的力學(xué)性能。RHC-TA水凝膠的這些特性在傷口密封和組織粘附方面具有良好的潛力。

圖７. RHC-TA水凝膠的體外粘附和止血性能。

受到海洋貽貝粘附過(guò)程的啟發(fā)，RHC-TA水凝膠的觸發(fā)過(guò)程模擬了其中的層次結(jié)構(gòu)，合成了具有優(yōu)越濕粘附能力的原位凝膠體系（圖７），并展現(xiàn)出了牢固的粘合強(qiáng)度和快速止血能力，為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打好了基礎(chǔ)。

圖8. RHC-TA水凝膠在水下、動(dòng)態(tài)環(huán)境中的粘附性能展示。

為了測(cè)試RHC-TA水凝膠是否在濕潤(rùn)環(huán)境中能否保持較高的粘附能力，本實(shí)驗(yàn)采用了RHC-TA水凝膠在水下環(huán)境中對(duì)心臟、肝、肺肌、骨、皮膚等不同的生物組織進(jìn)行粘附測(cè)試，均表現(xiàn)出緊密的粘附能力（圖８）。SEM圖像顯示RHC-TA水凝膠與組織之間的粘附界面緊密連接。

圖9. RHC-TA水凝膠作為手術(shù)密封膠在大鼠心臟出血模型中的體內(nèi)評(píng)價(jià)。

在大鼠心臟出血模型中使用RHC-TA水凝膠作為手術(shù)密封劑進(jìn)行測(cè)試（圖９）。將RHC和TA溶液在心臟出血部位進(jìn)行原位混合成膠，以防止致命的血液滲漏。H&E染色顯示，移植后7天，水凝膠與心臟組織表面粘附緊密，證實(shí)了其強(qiáng)而穩(wěn)定的密封效果。體外粘附試驗(yàn)表明，RHC-TA水凝膠在心臟組織上具有良好的粘附強(qiáng)度。對(duì)早期介入后生存數(shù)據(jù)的log rank分析顯示，RHC-TA水凝膠治療組與對(duì)照組相比有顯著改善，表明水凝膠具有停止致命出血和維持正常生理功能的潛力。第3天和第7天的免疫染色顯示，僅在第3天的時(shí)間點(diǎn)才有少量的局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（CD3）和巨噬細(xì)胞（CD68），但在第7天消失。隨后的大鼠肝臟出血模型也顯示出了良好的結(jié)果。
結(jié)論與展望
在這項(xiàng)研究中，作者模擬了天然材料的凝聚過(guò)程和分層組裝結(jié)構(gòu)，通過(guò)引入RHC和TA分子，首次開(kāi)發(fā)了一種非常有前途的水凝膠基手術(shù)密封膠。通過(guò)調(diào)節(jié)二者凝聚過(guò)程的參數(shù)，RHC和TA組裝體的構(gòu)象從顆粒狀聚集體演變?yōu)榫W(wǎng)狀聚集體（松散）和網(wǎng)狀聚集體（致密），伴隨著機(jī)械和粘附性能的顯著增強(qiáng)。由此得到的分層結(jié)構(gòu)水凝膠顯示出了幾個(gè)關(guān)鍵特征，滿足潛在的手術(shù)密封膠的要求：(1)易于加工和操作，(2)快速的凝膠和止血能力，(3)強(qiáng)大的機(jī)械和堅(jiān)韌的粘附性能，(4)超拉伸和自愈合能力，(5)良好的生物相容性。由于上述特性，水凝膠成功地應(yīng)用于原位切口部位，并迅速凝聚，以在潮濕和動(dòng)態(tài)的生物環(huán)境中實(shí)現(xiàn)強(qiáng)大的粘附。此外，RHC和TA本身都具有良好的生物相容性，且不需要額外的引發(fā)劑或交聯(lián)劑。本研究提出了一種手術(shù)密封膠，可廣泛應(yīng)用于體內(nèi)生物組織的粘附，為水凝膠結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供了科學(xué)和應(yīng)用基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
Zhongwei Guo, Zunghang Wei, Wei Sun. Coacervation-triggered hierarchically assembled hydrogels with application as surgical sealant. Biofabrication 15 (2023) 035021.
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acdc55