北京協(xié)和毛一雷教授團隊和馬文彬教授團隊發(fā)表: 3D 生物打印矩陣...

3D3D18(E18)(GelMA)3D neuMatrix3D neuMatrixE18/(MCAO/R)大鼠模型的存活狀態(tài)、功能特征及轉(zhuǎn)錄組特性。這些發(fā)現(xiàn)證實了3D neuMatrix內(nèi)多尺度神經(jīng)回路的形成，展現(xiàn)了其在神經(jīng)發(fā)育研究、疾病建模與藥物篩選及體外智能研究領(lǐng)域的寶貴潛力。
一、背景介紹：
大腦作為高度復(fù)雜的器官，其原代神經(jīng)細胞模型對神經(jīng)科學(xué)研究至關(guān)重要。傳統(tǒng)2D培養(yǎng)缺乏三維結(jié)構(gòu)和細胞外基質(zhì)(ECM)刺激，限制了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成。而3D支架、類器官等模型雖部分解決該問題，但仍存在細胞活力低或結(jié)構(gòu)調(diào)控不足等局限。3D生物打印技術(shù)憑借高通量、設(shè)計自由度高的優(yōu)勢，成為構(gòu)建功能性神經(jīng)組織的新途徑�；�于擠出的生物打印可精準控制細胞分布如皮層神經(jīng)元分層、軸突方向性，但原代神經(jīng)細胞對剪切力敏感，需優(yōu)化打印參數(shù)與生物墨水。本研究選用生物相容性良好的明膠甲基丙烯酰(GelMA)，結(jié)合既往打印功能性肝組織的經(jīng)驗，減少細胞損傷，促進突觸連接形成。

最終構(gòu)建的3D neuMatrix是新型3D生物打印原代神經(jīng)組織，具備復(fù)雜的局部與規(guī)模功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。通過單細胞測序和轉(zhuǎn)錄組分析證實，其在生理/病理狀態(tài)下均能高保真重現(xiàn)大腦皮層的細胞亞型與神經(jīng)發(fā)育動態(tài)，為神經(jīng)回路研究、疾病建模、藥物篩選及體外智能領(lǐng)域提供了創(chuàng)新平臺(圖1a)。

圖1. 3D neuMatrix的構(gòu)建流程。

二、材料和方法

2.1 原代皮層神經(jīng)元的3D生物打印

將混合后的生物墨水轉(zhuǎn)移至裝有21G針頭的滅菌注射器中，裝入3D生物打印機，并預(yù)設(shè)溫度。對噴嘴和成型室溫度進行微調(diào)，以確定在打印過程中保持最高細胞存活率的理想條件。生物打印過程使用基于擠出的生物打印機(SUNP BIOTECH公司的BioMaker 系列生物3D打印機)，遵循先前建立的方案。簡而言之，3D neuMatrix的整體形狀設(shè)計為立方體，框架間設(shè)有獨立通道，可最大化原代神經(jīng)細胞與培養(yǎng)基的接觸面積。通過3D生物打印機在24孔板的各孔內(nèi)以逐層擠出的方式連續(xù)制備 3D neuMatrix。打印速度設(shè)置為4.8 mm s-1，擠出速度設(shè)置為1.5 mm³ s-1。

隨后，3D neuMatrix經(jīng)7.5 mW/cm-2的405 nm光照射10秒以促進交聯(lián)，之后加入1 mL完全培養(yǎng)基，在37°C、5% CO₂條件下培養(yǎng)。整個生物打印過程耗時約1小時。神經(jīng)元成熟通過體外培養(yǎng)7天誘導(dǎo)，每2天更換一半培養(yǎng)基，隨后進行后續(xù)評估。

三、結(jié)果

3.1 3D neuMatrix 的關(guān)鍵生物學(xué)特性

將E18大鼠原代皮質(zhì)細胞與GelMA、光引發(fā)劑按1.5×10⁷ cells/mL密度混合，采用21G 噴嘴(內(nèi)徑510 μm)擠出打印，經(jīng)405 nm光(7.5 mW/cm²)交聯(lián)10秒，構(gòu)建7×7×1.5 mm 含500 μm互連通道的6層結(jié)構(gòu)。優(yōu)化后的參數(shù)減少了剪切力損傷，且可通過自修復(fù)水凝膠浴實現(xiàn)微型大腦等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的浮動打印(圖1b)。細胞活力在DIV 7達峰值(299±20%)，28天培養(yǎng)仍保持活性。HE染色和SEM顯示，細胞在多孔水凝膠中形成直徑超200 μm的簇，神經(jīng)突相互連接，而2D培養(yǎng)細胞分布隨機(圖1c-g)。該模型通過生物墨水與打印工藝優(yōu)化，實現(xiàn)了原代神經(jīng)細胞的高活性三維封裝。

3.2 3D neuMatrix 中的多尺度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

體外培養(yǎng)期間，細胞簇體積顯著增長，前3天擴大3倍(8408 μm3增至30215 μm3)(圖2a,b)。Ki67陽性細胞數(shù)在DIV4達峰(42.8±5.6個/ROI)，DIV7降至25.5±4.3個/ROI，與體積增長和整體活力趨勢一致(圖2c)。細胞簇主要由成熟的NeuN陽性神經(jīng)元組成，富含MAP2陽性突起和深染的SYN(表明豐富突觸)。Nestin陽性干細胞極少。盡管未主動篩選，GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量少于神經(jīng)元，并在神經(jīng)簇內(nèi)形成沿神經(jīng)突起延伸的支架樣結(jié)構(gòu)(圖2d,e)。Imaris重建顯示，局部尺度上相鄰簇間存在復(fù)雜多分支神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)(圖2f)。毫米尺度上，整個3D neuMatrix形成了高度類似體內(nèi)大腦樞紐和投射結(jié)構(gòu)的三維神經(jīng)網(wǎng)(圖2g)。

圖2. 3D neuMatrix中獨特的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

3.3 3D neuMatrix 的功能連接與藥物響應(yīng)性

利用Fluo-4 AM可視化鈣振蕩，評估3D neuMatrix的神經(jīng)功能。微觀層面，簇內(nèi)神經(jīng)元獨立振蕩并間歇性協(xié)調(diào)放電。介觀尺度下，神經(jīng)簇可分為5組，組內(nèi)鈣放電高度同步，相距2 mm的簇組間也存在同步放電，證實其形成大規(guī)模功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(圖3a-e)。分析 DIV1-14的鈣信號發(fā)現(xiàn)，平均放電率、檢測到鈣放電的簇百分比隨培養(yǎng)時間上升，DIV 14略有下降，與細胞活力趨勢一致。全局平均相關(guān)性持續(xù)增加。綜合考慮，選擇DIV 7為后續(xù)研究時間點(圖3f - h)。通過神經(jīng)遞質(zhì)受體拮抗劑處理探究小分子影響，抑制GABA受體(BIC、PTX)顯著提升放電率，抑制谷氨酸受體(NBQX、AP5)則降低放電率；除AP5外，其余處理后全局平均相關(guān)性下降。該結(jié)果表明，興奮性與抑制性神經(jīng)元共同參與網(wǎng)絡(luò)形成，二者平衡維持同步性，且3D neuMatrix對小分子的功能響應(yīng)特性，使其適用于CNS疾病建模與藥物篩選(圖3i - l)。

圖3. 3D neuMatrix神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能動態(tài)特性。

3.4 3D neuMatrix 中皮層轉(zhuǎn)錄組譜的重建

為驗證3D生物打印神經(jīng)組織的轉(zhuǎn)錄保真度，對2D培養(yǎng)神經(jīng)元、3D neuMatrix和E18大鼠皮層進行RNA-seq分析。PCA顯示3D neuMatrix與E18皮層的全局轉(zhuǎn)錄譜相關(guān)性顯著高于2D培養(yǎng)(圖4a,b)。通過差異基因(DEGs)分析，3D neuMatrix中E18皮層特征性上調(diào)/下調(diào)基因的富集分數(shù)分別為0.41和-0.39，顯著優(yōu)于2D培養(yǎng)(圖4c-f)。GO和KEGG分析表明，3D neuMatrix激活細胞互作、ECM組織等通路，而2D培養(yǎng)富集鈣信號及神經(jīng)退行性相關(guān)通路(圖4g-i)。GSVA進一步證實3D neuMatrix與E18皮層的通路富集模式更接近，尤其在神經(jīng)元投射和突觸傳遞等特征上(圖4j)。對關(guān)鍵基因子集的分析顯示，3D neuMatrix在神經(jīng)元突觸、ECM-受體互作等通路更貼近E18皮層，而大腦皮層特有的神經(jīng)發(fā)育調(diào)控通路在體外模型中富集度較低。綜上，3D neuMatrix在分子層面高度重現(xiàn)體內(nèi)神經(jīng)組織特征，具備優(yōu)異的生物學(xué)保真度。

圖4.基于RNA測序驗證3D neuMatrix的基因表達保真度。

3.5 3D neuMatrix 對大腦皮層細胞組成的重現(xiàn)

為探究3D neuMatrix的細胞組成及時序動態(tài)，在DIV 1和DIV 7開展snRNA-seq(圖 5a,b)，獲取36304個細胞并完成類型注釋(圖5a,c,d)。UMAP分析顯示神經(jīng)亞群分布與體內(nèi)皮層神經(jīng)元分層一致，與大鼠皮層數(shù)據(jù)合并后分類穩(wěn)定，細胞類型比例也與體內(nèi)高度吻合，證實其精準重現(xiàn)大腦皮層細胞組成。

培養(yǎng)期間的細胞組成符合體內(nèi)發(fā)育趨勢(圖5e)，尤其是神經(jīng)膠質(zhì)細胞。DIV7時神經(jīng)前體細胞(NPC)從8.24 %降至1.61 %，星形膠質(zhì)細胞(ASC)和少突膠質(zhì)細胞(ODC)分別增至 13.86 %和3.98 %。興奮性神經(jīng)元(EN)比例從46.64 %降至22.34 %，抑制性神經(jīng)元(IN)穩(wěn)定在22.9%左右，與鈣振蕩同步性增加一致。細胞周期分析表明DIV7時細胞分裂能力減弱。(圖5b,e,f)。

偽時間分析顯示，神經(jīng)元呈現(xiàn)從未成熟神經(jīng)元(IMN)到分化神經(jīng)元的發(fā)育軌跡。IMN高表達放射狀膠質(zhì)細胞標志物(Fabp7、Vim)，兼具泛神經(jīng)元特征但缺乏成熟標志物，可能從分裂狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樾菝郀顟B(tài)；成熟神經(jīng)元的神經(jīng)投射和遞質(zhì)分泌功能隨時間顯著增強，突觸組裝富集度維持較高水平(圖5g-j)。

圖5. DIV 1和DIV 7時3D neuMatrix的單細胞核RNA測序(snRNA-seq)分析。

3.6利用3D neuMatrix構(gòu)建缺血性中風模型

為評估3D neuMatrix在疾病建模與藥物篩選中的潛力，以缺血性中風為模型，通過氧-葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)處理發(fā)現(xiàn)，OGD 4小時后細胞活力降至49.0±0.6%，鈣振蕩的放電速率和放電細胞百分比顯著降低，全局相關(guān)性呈上升趨勢(圖 6a-e)。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，3D neuMatrix的OGD/R模型與大鼠MCAO/R模型的轉(zhuǎn)錄特征更吻合，其上調(diào)的缺氧響應(yīng)、ECM相互作用等通路，較2D培養(yǎng)更準確模擬了缺血性中風的神經(jīng)組織損傷機制(圖6f-m)。藥物篩選實驗中，依達拉奉和丁苯酞未能改善OGD/R后的細胞活力與功能，可能因4小時 OGD已造成不可逆損傷。綜上，3D neuMatrix在神經(jīng)疾病建模和藥物研發(fā)中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，為體外研究提供了更貼近體內(nèi)環(huán)境的平臺。

圖6. 3D neuMatrix的OGD/R建模與缺血性中風特征重現(xiàn)。

四、討論

利用3D生物打印技術(shù)構(gòu)建了體外神經(jīng)模型3D neuMatrix，該模型僅需7天即可形成具有多尺度功能連接的復(fù)雜可重現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。其鈣信號特征與大腦皮層功能架構(gòu)相似，基因表達譜比2D培養(yǎng)更貼近E18皮層，且通過單細胞測序證實可重現(xiàn)大腦皮層細胞組成及發(fā)育動態(tài)，為神經(jīng)環(huán)路機制、CNS疾病機制、藥物篩選及組織工程研究提供了有價值的體外平臺。

相比傳統(tǒng)2D培養(yǎng)和其他3D建模方法，3D neuMatrix在高通量構(gòu)建、可重復(fù)性及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)空間組織精度上優(yōu)勢顯著。它優(yōu)化了原代皮層細胞的生物打印流程，避免了iPSC衍生神經(jīng)元成熟度不足的問題，能構(gòu)建多種高保真CNS模型；其展現(xiàn)的多尺度功能性神經(jīng)連接源于3D生物打印的預(yù)設(shè)空間cues，結(jié)合可擴展性有望用于神經(jīng)組織修復(fù)與生物計算；在疾病建模方面，可高通量篩選藥物，結(jié)合基因編輯技術(shù)能模擬多種神經(jīng)退行性疾病。

該模型也存在一定局限性，如生物墨水基于明膠無法完全重現(xiàn)大腦ECM，打印過程可能造成剪切力損傷，培養(yǎng)期間細胞簇增大可能引發(fā)缺氧反應(yīng)，且缺乏血管化結(jié)構(gòu)影響病理模擬完整性。未來需通過優(yōu)化生物墨水、引入新興生物制造技術(shù)及構(gòu)建血管化結(jié)構(gòu)等方式提升模型的生理模擬真實性。

五、結(jié)論

綜上，利用3D生物打印技術(shù)構(gòu)建了體外神經(jīng)組織3D neuMatrix，其具有明確的細胞組成、神經(jīng)環(huán)路及可調(diào)控的空間組織。單細胞分析顯示，體外培養(yǎng)期間神經(jīng)元亞型和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化，神經(jīng)通訊相關(guān)基因表達上調(diào)。通過3D neuMatrix進行的疾病建模證實，其有望為CNS疾病的發(fā)病機制和治療研究提供更貼近生理的模型。

六 、參考文獻

H. Yang, J. Zhang, Y. Li, Z. Zhong, W. Li, H. Luo, Y. Liu, L. Ouyang, Z.Jiang, Y. Sun, H. Sun, L. Liu, H. Yang, Y. Wang, N. Yang, W. Ma, Y. Mao,Multiscale Organization of Neural Networks in a 3D Bioprinted Matrix. Adv. Sci.2025, e04455.