基于透明質(zhì)酸的新型生物墨水開發(fā)及其在生物3D打印含神經(jīng)分布的干細胞源性角膜基質(zhì)...

背景介紹

生物3D打印允許將細胞精確地沉積在模仿天然組織的復雜和不規(guī)則形狀的結(jié)構(gòu)體中。此前，人類角膜基質(zhì)模擬結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過基于擠出的打印技術(shù)、激光輔助的生物3D打印技術(shù)和立體光刻進行了生物3D打印。雖然生物3D打印在制造角膜模擬結(jié)構(gòu)方面具有巨大的潛力，但是目前的技術(shù)方法僅僅集中在忽視角膜微結(jié)構(gòu)的3D 宏觀形狀上。

以點擊化學為基礎的水凝膠是自發(fā)形成的混合反應化合物，這些反應是快速的、自發(fā)的、多功能的和極具選擇性的。通常，疊氮炔環(huán)加成反應、 Diels-Alder 反應和巰基烯化學由于反應組分和原子經(jīng)濟性反應產(chǎn)物的雙正交性而被稱為點擊化學。然而，這些方法并不適用于制造生物墨水與活細胞的3D 打印，因為他們需要嚴格的反應條件，有毒催化劑或高溫。腙交聯(lián)是由雙正交官能團，即醛基和肼基之間的動態(tài)共價偶聯(lián)形成的一種快速有效的偽點擊反應。以 HA 為基礎的腙交聯(lián)水凝膠已經(jīng)被研究用于模擬角膜結(jié)構(gòu)的組織工程。然而，HA 基水凝膠的腙交聯(lián)的凝膠時間很快(< 30s) ，導致生物制備窗口狹窄，因此這些水凝膠不能用作生物3D打印的生物墨水。因此，基于化學點擊的水凝膠如何提供理想的生物制造窗口、高分辨率和細胞活力的新型生物墨水是基于擠出的生物3D打印的迫切需要。這種生物墨水可以使用動態(tài)共價化學來制備，這種化學是快速和有效的，不需要任何催化劑或光源。

研究開發(fā)了一種基于 HA 的生物墨水，可以用于人類角膜基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)的生物3D打印。所開發(fā)的水凝膠滿足下一代生物墨水的要求，包括優(yōu)異的打印性，形狀保真度以及與人脂肪干細胞(hASC) ，hASC 衍生的角膜基質(zhì)細胞(hASC-CSKs)和 hPSC- 神經(jīng)元的細胞相容性。此外，研究還探索了幾種用于角膜基質(zhì)生成的生物3D打印策略，并分析了所得到的基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)的微觀結(jié)構(gòu)。研究通過在豬角膜器官培養(yǎng)模型中驗證生物3D打印角膜基質(zhì)的組織整合。最后，為了證明所開發(fā)的生物墨水和生物3D打印的角膜基質(zhì)的實用性，研究探索了對打印角膜基質(zhì)的神經(jīng)支配，并制作了具有神經(jīng)支配的第一個生物3D打印的角膜基質(zhì)組織模型。

本研究合成了四種生物墨水組分：①多巴胺與透明質(zhì)酸(HA-DA)的接枝；②利用碳二酰亞胺偶聯(lián)化學進行碳二酰肼(CDH)與透明質(zhì)酸(HA-CDH)的綴合；③多巴胺修飾的透明質(zhì)酸(HA-DA-CDH)上接合 CDH；④HA-醛(HA-Ald)的合成。使用兩種 HA 基腙交聯(lián)生物墨水，以評估共軛多巴胺對生物墨水特性的影響。第一種生物墨水含有 HA-CDH 和 HA-Ald 作為交聯(lián)組分(HA 生物油墨)和另一種 HA-DA-CDH 和 HA-Ald (HA-DA 生物油墨)。用紫外-可見分光光度法在標準曲線的線性部分畫出最佳擬合線，測定 HA-DA 對透明質(zhì)酸雙糖重復單位的多巴胺功能化程度為4.5 mol%。DA 顯示出與文獻一致的以下特征峰: 3345cm-1(胺 N-H 拉伸) ，3039cm-1(芳香族 O-H 拉伸) ，2946cm-1(烷基 C-H 拉伸) ，1614cm-1(胺 N-H 彎曲) ，1493cm-1(芳香族 C = C 拉伸)和650-1300cm-1區(qū)域中由于脂肪鏈的幾個峰。HA 和 HA-DA 都在3100 ~ 3600cm-1處出現(xiàn)寬峰，這是由于 -OH 基團和胺N-H 基團的伸縮振動所致。研究還觀察到，由于透明質(zhì)酸骨架中的 C-O-C 半縮醛糖單位，在1033-1152cm-1附近出現(xiàn)峰值。HA 和 HA-DA 中還存在羧酸鹽在1375-1405cm-1附近的不對稱伸縮振動，-CH2基團在2895cm-1附近的對稱伸縮振動，酰胺 I 和 II 在1550-1561cm-1附近的條帶。在 HA-DA 的情況下，由于 DA 與 HA 的羧基結(jié)合，在1645cm-1和1733cm-1處出現(xiàn)獨特的 C = O 和酰胺拉伸。

通過打印雙層網(wǎng)格評價了 HA 基生物墨水的可打印性。HA 生物墨水在打印時沒有形成長絲(圖1(f)) ，表現(xiàn)為流體狀，并且在打印過程中未能維持打印網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。相比之下，HA-DA 生物墨水顯示出良好的長絲形成與和清晰的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。在這里，一個90分鐘的生物制造窗口獲得 HA-DA 生物墨水打印。隨后，研究進一步分析了 HA-DA 生物墨水的形狀保真度，打印六層后立即測量334 ± 58μm 的網(wǎng)格線厚度(圖1(g))。在培養(yǎng)的7天內(nèi)，只有363 ± 77μm 的輕微增加。打印后立即獲得0.95 ± 0.04的 PR，培養(yǎng)7天后僅略有下降至0.92 ± 0.02(圖1(h))。經(jīng)過七天的培養(yǎng)，打印的格子結(jié)構(gòu)是均勻的，清晰可見的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)和開放的孔(圖1(i))。

圖1. HA-DA 生物油墨可支持高精度打印，具有良好的形狀保真度和自愈合性能。(a) HA-DA 和 HA 生物油墨在連續(xù)流動下的剪切變稀。(b) HA-DA 和(c) HA 生物油墨在循環(huán)應變下的剪切變稀。(c)完全交聯(lián)(d) HA-DA 生物油墨和(e) HA 生物油墨的應變回收率。(f)具有兩個不同印刷參數(shù)的 HA 和 HA-DA 生物油墨的可打印性。比例尺5毫米。(g)纖維厚度和(h)孔隙因子評估印刷 HA-DA 生物油墨結(jié)構(gòu)的形狀保真度。(i)打印后和培養(yǎng)七天的印刷格子圖像。比例尺5毫米。(j)三維生物打印結(jié)構(gòu)的儲存模量，表明培養(yǎng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。(k)印刷結(jié)構(gòu)隨時間的降解和膨脹行為。(l) HA-DA 生物油墨的透過率。(m) HA-DA 生物油墨在定量機械壓縮試驗中表現(xiàn)出組織自愈合特性。

為了探究 HA-DA 生物墨水的細胞相容性，研究將生物3D打印的 hASC 和 hASC-CSK 分成二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)。研究在打印一天和七天后評估細胞的活力，兩組細胞均有 > 95% 的高細胞活力(圖2(a))。死亡細胞的數(shù)量在培養(yǎng)時沒有增加。與 hASC-CSK 相比，hASC 在打印過程中的存活率略高(圖2(a))。免疫熒光(IF)染色和 PrestoBlueTM 分析進一步驗證細胞相容性。用鬼筆環(huán)肽對打印線條進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)1天后兩種細胞類型的細胞形態(tài)均拉長(圖2(b))。直到第7天，hASC 檢測到細胞數(shù)量明顯增加，在此期間，它們?nèi)匀话凑赵瓉淼拇蛴∧Ｊ奖３謱�齊。在第1天和第3天，hASC-CSK 的數(shù)量略有增加，然而此后沒有明顯的細胞增殖。兩種細胞在打印后均表達增殖標志物 Ki67。與第1天和第3天相比，第7天在兩個層狀細胞系和三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)中 hASCs 顯示出更高的細胞增殖(p < 0.001)。另外，hASC-CSK 表現(xiàn)出強烈的 lumican 表達(圖2(e))。為了進一步評估打印基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的組織形成，研究在打印14天后對3D 基質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了共聚焦成像。檢測到兩種細胞類型的縫隙連接蛋白連接蛋白43(Cx43)的陽性染色，表明在打印結(jié)構(gòu)中形成細胞-細胞相互作用(圖2(f))。在兩種細胞類型的三維共聚焦圖像中也可以看到細胞形態(tài)和細胞網(wǎng)絡(圖2(g)-(h))。

圖2. HA-DA 生物墨水與 hASC 及 hASC-CSK 的細胞相容性研究。(a)打印后7天(活細胞 = 綠色，死細胞 = 紅色) ，以線性結(jié)構(gòu)和3D 結(jié)構(gòu)打印的細胞存活率。(b)打印后一天，三天和七天打印行中 hASC 和 hASC-CSK 的細胞骨架(鬼筆環(huán)肽 = 紅色)和增殖細胞(Ki67 = 綠色)。比例尺500微米。用 PrestoBlueTM (* * = p < 0.001)分析打印1,3和7天后，以線性結(jié)構(gòu)(c)和3D 結(jié)構(gòu)(d)打印的 hASC 和 hASC-CSK 的細胞增殖。(e)打印品打印7天后的細胞形態(tài)、增殖和角膜基質(zhì)標記物表達。增殖細胞對 Ki67(綠色)染色，鬼筆環(huán)肽(紅色)顯示細胞形態(tài)，Lumican (紫色)檢測角膜基質(zhì)標記物表達。比例尺200微米。(f)打印后14天后生物3D打印基質(zhì)中細胞-細胞相互作用的共聚焦圖像。用鬼筆環(huán)肽(紅色)觀察細胞骨架，用間隙連接蛋白 Cx43(綠色)觀察細胞-細胞相互作用。(g)打印14天后細胞在3D 結(jié)構(gòu)中的3D 旋轉(zhuǎn)共焦圖像。(h)來自三維旋轉(zhuǎn)共焦圖像的生物3D打印結(jié)構(gòu)的側(cè)面圖。比例尺100μm。

應用HA-DA生物墨水實現(xiàn)角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的生物3D打印

接下來，研究探討了三種不同的角膜基質(zhì)組織工程打印策略，并探討了打印結(jié)構(gòu)體在培養(yǎng)上的相似性。將未分化的 hASC 在生物打印后也被打印并保存在它們的增殖培養(yǎng)基中。在預分化打印方法中，hASC 在打印前被預分化為 CSK。在打印后誘導分化方法中，通過將打印結(jié)構(gòu)置于 CSK 分化培養(yǎng)基中，在打印印后開始 hASC 向 CSK 的分化。以上三種打印策略的生物3D打印結(jié)構(gòu)表明，當用 HE 染色檢查橫截面時，hASC 和 hASC-CSK 均在整個3D 結(jié)構(gòu)中稀疏地分布(圖3(a)和(b))。hASCs 在整個打印結(jié)構(gòu)中呈拉長的細胞形態(tài)，打印前分化 hASC-CSK 的方法也可以觀察到類似的形態(tài)。相比之下，在打印后分化的 hASC-CSK 的橫截面上看到的延伸率要小得多(圖3(a)和(b))。在不同打印策略的培養(yǎng)過程中，細胞形態(tài)有很大的差異(圖3(c))。在打印結(jié)構(gòu)中，hASCs 呈細長的細胞形態(tài)和致密的細胞網(wǎng)絡，而分化的 hASC-CSK 均表現(xiàn)出較多的樹突狀細胞形態(tài)，細胞體呈圓形，細胞外延較少。所有的打印方法中均可以觀察到針對細胞-細胞相互作用的Cx43染色陽性 (圖3(d))。細胞-細胞相互作用的數(shù)量在打印后分化組別中最高。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]波形蛋白是一種主要的結(jié)構(gòu)性中間纖維蛋白，在正常的 CSK 中低水平表達。在 IF 染色的打印前和打印后分化方法中，hASC-CSK 均檢測到波形蛋白的低表達(圖3(d)) ，而 hASC 中沒有表達。與生物3D打印的 hASC 相比，打印前分化的 hASC-CSK 檢測到 VIM 表達增加(p < 0.05)。相反，在 IF 染色中，hASC 顯示 α-SMA 的陽性表達，而在打印前和打印后分化的 hASC-CSK 中很少或沒有表達 α-SMA。Lumican 是富含亮氨酸的小蛋白多糖家族的成員，也是角膜基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的主要 KS 蛋白多糖。在這里通過共聚焦最大密度投影圖像(圖3(e))和具有纖維組織和密度的組織切片的 IF 染色(圖3(f))顯示的打印前分化策略中，在用 hASC-CSK 制備的打印結(jié)構(gòu)中檢測到最高的 lumican 表達。在 qPCR 分析中，與2D中的未分化 hASC (p < 0.001)和3D 打印的 hASC (p < 0.01)(圖3(g)) 相比，打印前和打印后分化的方法均顯示 LUM 表達增加。然而，與作為陽性對照的 hCSK 相比，hASC-CSK 中 LUM 和 VIM 的表達較低(p < 0.001)。這些數(shù)據(jù)表明，這兩種打印策略已經(jīng)使結(jié)構(gòu)中的 hASC 向角膜角質(zhì)細胞譜系的分化開啟。在打印14天后的打印結(jié)構(gòu)照片(圖3(h))中可以檢測到帶有 hASC 的打印結(jié)構(gòu)的不透明度增加。相比之下，用打印前和打印后分化的方法所構(gòu)建的樣品顯示出透明的結(jié)構(gòu)。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]圖3. 人眼角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的生物3D打印方案。(a)打印 hASC 21天后冷凍切片的 HE 染色，打印前分化的 hASC-CSK 和打印后分化的 hASC-CSK。比例尺500微米。(b)細胞分布，形態(tài)和取向。比例尺200微米。(c)波形蛋白(紫色) ，Cx43(綠色)和 α-SMA (紅色)(d)和 lumican (紅色)(e)的共焦最大密度投影。比例尺100微米。(f)在打印21天后從冷凍切片顯現(xiàn)的 Lumican (紫色)表達。比例尺200微米。(g) LUM 和 VIM 的 qPCR 分析(* = p < 0.05，* * = p < 0.001)。hCSK 作為對照。培養(yǎng)14d 后生物3D打印角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的透明度(h)。用 Hoeschst 33342(藍色)顯示細胞核。

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生物3D打印角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)與宿主組織的整合

在探索了用 HA-DA 生物墨水生物3D打印人類角膜基質(zhì)的可能性之后，研究接下來評估了打印的角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)體植入體內(nèi)角膜缺損模型后的性能。根據(jù)前述實驗結(jié)果，選擇了打印前分化的構(gòu)建策略。研究對切除角膜的豬進行了前板層角膜移植手術(shù)，將生物3D打印的角膜基質(zhì)移植到傷口部位。培養(yǎng)21天后，采用 HE 染色和 IF 染色，觀察打印結(jié)構(gòu)與宿主角膜的整合情況。植入的生物3D打印角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)期間沒有額外固定的情況下可以保持在原位。21天后，生物3D打印的角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示出與宿主角膜良好的附著和粘附(圖4(c))。IF 染色顯示打印結(jié)構(gòu)中含有STEM121陽性細胞，即打印結(jié)構(gòu)中仍然存在人類細胞。高倍圖像(圖4(g))表明，打印結(jié)構(gòu)是緊密連接到基礎宿主基質(zhì)。此外，當檢查植入結(jié)構(gòu)和宿主角膜的界面(圖4(h))時，在打印結(jié)構(gòu)內(nèi)觀察到 STEM121陰性的細胞，表明豬細胞遷移到打印結(jié)構(gòu)。此外，在頂端一側(cè)，宿主豬上皮已經(jīng)在生物3D打印的角膜結(jié)構(gòu)上生長(圖4(i))。豬角膜上皮覆蓋了 STEM121陽性的含有打印基質(zhì)結(jié)構(gòu)的人類細胞(圖4(j))。最后，在離體培養(yǎng)物的打印結(jié)構(gòu)中也檢測到 lumican 的少量表達(圖4(k))。

圖4. 在豬體內(nèi)培養(yǎng)21天后的生物3D打印角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)。(a)將生物3D打印結(jié)構(gòu)植入 Barron 人工前房中，(b)植入生物3D打印仿生基質(zhì)結(jié)構(gòu)的豬眼球，(c)生物3D打印角膜基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)的體內(nèi)培養(yǎng)后的 HE 染色，(d)中央人類角膜基質(zhì)，比例尺200μm，(e)用人細胞特異性標記 STEM121(綠色)和鬼筆環(huán)肽(紅色)分析生物3D打印的角膜基質(zhì)與宿主整合的情況。(f)將人角膜基質(zhì)作為對照。比例尺500微米。(g)來自 HE 和(H) IF 染色的生物3D打印結(jié)構(gòu)與素質(zhì)豬基質(zhì)之間界面的高倍放大圖像。STEM121(綠色)陰性的細胞出現(xiàn)在打印結(jié)構(gòu)中(白色 *) ，表明宿主細胞與打印的基質(zhì)結(jié)構(gòu)整合。(i) HE 染色和(j) IF 染色的生物3D打印表層結(jié)構(gòu)的高倍圖像。(k)體內(nèi)培養(yǎng)的生物3D打印結(jié)構(gòu)中角膜基質(zhì)標記物 Lumican (紅色)的表達。(1)以人眼角膜為對照。比例尺100μm ((g)-(l))的細胞核用 Hoechst 33342(藍色)顯示。

生物3D打印角膜基質(zhì)的神經(jīng)長入和支配

采用 LIVE/DEAD 方法研究了hPSC-神經(jīng)元與 HA-DA 生物墨水的細胞相容性。神經(jīng)元表現(xiàn)出良好的生存能力。大多數(shù)細胞在打印1天后仍然存活，并且在打印7天后觀察到死亡細胞的數(shù)量減少(圖5(a))。水凝膠中的細胞表達神經(jīng)元標志物 βIII-tube 和 MAP。打印1天后，神經(jīng)元顯示出短的神經(jīng)突生長，并且在打印7天后形成長軸突的清晰的神經(jīng)元網(wǎng)絡(圖5(b))。在兩個時間點均檢測到細胞增殖標記物的暴打(Ki67陽性)，但7天后陽性細胞的數(shù)量減少(圖5(c))。上述發(fā)現(xiàn)表明 HA-DA 生物墨水與 hPSC 來源的神經(jīng)元細胞具有良好的細胞相容性。通過將神經(jīng)元細胞打印到結(jié)構(gòu)的外圍，成功地將神經(jīng)支配加入到生物3D打印的基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)中(圖5(d))。對于沒有靶細胞的對照組(圖5(d) i)或以 hASC-CSK 作為靶細胞的打印結(jié)構(gòu)(圖5(d) ii) ，研究打印基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支配發(fā)展。無靶細胞的樣品培養(yǎng)21天，以 hASC-CSK 為靶細胞的樣品培養(yǎng)14天。在兩組中，隨著時間的推移都檢測到向中央角膜方向的長突生長(圖5(e)和(f))。然而，在以 hASC-CSK 為靶細胞的樣品中，神經(jīng)支配似乎發(fā)展得更快、更早。培養(yǎng)7天后的含 hASC-CSK 的3D 角膜結(jié)構(gòu)的中心部分已經(jīng)可以看到表達 NFH 的長軸突，而在對照組中，直到培養(yǎng)14天，在沒有靶細胞的生物墨水中不能看到軸突。對照組培養(yǎng)21天后軸突生長情況與對照組相似。在共培養(yǎng)組中，在 hASC-CSK 之間生長的軸突在打印14天后形成了幾個軸突的束(圖5(f))。

圖5.受神經(jīng)支配的生物3D打印角膜基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)。(a)生物墨水中的神經(jīng)細胞在打印一天和七天后的活性(活細胞 = 綠色，死細胞 = 紅色)。(b)打印后1天和7天，在打印行中細胞的神經(jīng)元標志物 βIII 桶(紅色)和 MAP2(綠色)的表達。(c)增殖標記 Ki67(洋紅色)在打印行后1天和7天的陽性染色。(d).實驗組的示意圖: 生物3D打印角膜基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)，其中神經(jīng)元細胞被生物打印到角膜的外圍(位置突出顯示紫色方塊)。中央部分為(i) 沒有細胞的生物墨水 (對照)或(ii)含hASC-CSK的生物墨水(位置突出顯示在黃色方塊)。在對照組和以 hASC-CSKs 作為神經(jīng)元中心靶細胞組別中觀察隨時間發(fā)展的神經(jīng)支配表達物(e) NFH (綠色)和(f)鬼筆環(huán)肽(洋紅色)的 hASC-CSKs 染色。比例尺為100微米。

結(jié)論和展望

研究開發(fā)了一種基于 HA 的生物墨水，使用動態(tài)共價化學，以滿足下一代生物墨水的要求，具有優(yōu)異的打印適性，穩(wěn)定性，細胞相容性以及打印后不使用光交聯(lián)的優(yōu)點。HA-DA 生物墨水具有良好的力學性能和自愈合性能。同時研究證明了開發(fā)的生物墨水使用臨床潛在的人類干細胞完成人類角膜基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)生物3D打印的可行性。生物3D打印的角膜基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)能夠良好的與宿主組織整合。研究制造了第一個具有神經(jīng)支配的生物3D打印角膜組織模型，證明了開發(fā)的生物墨水和打印的人類干細胞來源的角膜基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)在未來的各種角膜組織工程應用中具有巨大的潛力。

參考文獻

Mörö A, Samanta S, Honkamäki L, et al. Hyaluronic acid based next generation bioink for 3D bioprinting of human stem cell derived corneal stromal model with innervation[J]. Biofabrication, 2022, 15(1): 015020.

https://doi.org/10.1126/10.1088/1758-5090/acab34

參考文獻

[color=rgba(0,]https://doi.org/10.1126/10.1088/1758-5090/acab34