生物打印里程碑！上億細胞密度下突破50um分辨率！

來源： EFL生物3D打印與生物制造

三維 （3D） 工程組織是由生物材料支架和活細胞組成的人工功能組織。工程組織已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究、疾病建模、藥物測試、個性化醫(yī)療、再生醫(yī)學(xué)和器官移植。與傳統(tǒng)的2D單層細胞模型或動物模型相比，3D工程組織有望準確概括天然組織的3D結(jié)構(gòu)，細胞類型以及物理和生化環(huán)境，為體外組織或器官模型提供更好的生物相關(guān)性，可擴展性和可重復(fù)性。此外，用自體細胞開發(fā)的3D工程可移植組織和器官可能會潛在地減輕與器官供體短缺和免疫排斥相關(guān)的問題。因此，組織工程引起了大量的研究興趣。然而，同時滿足高細胞密度、高細胞活力和高分辨率的要求是十分具有挑戰(zhàn)性的。特別是，由于光散射，基于數(shù)字光處理的3D生物打印的生物打印分辨率隨著生物墨水細胞密度的增加而受到影響。

為解決該問題，來自美國加州大學(xué)圣地亞哥分校的Shaochen Chen團隊開發(fā)了一種新的方法來緩解這種由散射引起的生物打印分辨率的惡化。結(jié)果表明，在生物墨水中加入碘二醇，可以將光散射減少10倍，并顯著提高具有HCD的生物墨水的制造分辨率。本研究成功實現(xiàn)了利用每毫升細胞密度為1億的生物墨水進行50微米分辨率的制造。為了展示其在組織/器官三維生物打印中的潛在應(yīng)用，本研究制作了具有細小血管網(wǎng)絡(luò)的HCD厚組織。組織在灌流培養(yǎng)系統(tǒng)中存活，培養(yǎng)14天后可以觀察到內(nèi)皮化和血管生成。相關(guān)工作以題為“High cell density and high-resolution 3D bioprinting for fabricating vascularized tissues”的文章發(fā)表在2023年2月22日的國際頂級期刊《Science Advances》。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容
雖然基于擠壓原理的3D打印可以達到50 μm的標稱分辨率，而基于光的打印可以達到微米級的標稱分辨率，但通常只有在特定的優(yōu)化制造條件下才能實現(xiàn)這樣的精細特征，而且其中使用的是沒有封裝細胞的低生物相容性材料。在實際的生物打印應(yīng)用中，使用細胞封裝的生物油墨與標稱情況相比，制造分辨率往往大大惡化。對于基于擠壓的3D生物打印，增加細胞密度或在生物墨水中使用球體需要使用更大的噴嘴。否則，由于擠壓過程中所經(jīng)歷的剪切應(yīng)力，細胞活力明顯受到影響。通常，對于1000萬個細胞/ml或更高的密度，應(yīng)該使用200 μm或更大的噴嘴，其打印分辨率在200- 500 μm之間。對于基于光的方法，由于細胞引起的光散射效應(yīng)，典型的細胞封裝生物打印分辨率為幾十到幾百微米。雖然一些化學(xué)添加劑可以減輕光散射引起的不必要的聚合，但這些化學(xué)物質(zhì)通常具有細胞毒性。在DLP和大體積3D生物打印中，部分研究人員也提出了計算方法來減輕散射的影響并提高細胞負載生物墨水的制造分辨率。然而，這些研究僅限于低細胞密度(≤1000萬個細胞/ml)。因此，很難制造同時具有HCD(≥2000萬個細胞/ml)、高細胞活力(≥80%)和高制造分辨率(≤50 μm)的3D生物打印結(jié)構(gòu)。本研究稱之為3D生物打印中的密度-生存力-分辨率三難困境(圖1)。

圖1 在HCD生物墨水中實現(xiàn)高制造分辨率

研究表明，通過折射率調(diào)節(jié)，細胞和周圍生物材料之間折射率不匹配引起的散射可以最小化(圖1)。生物墨水光學(xué)特性的測量和光傳播的模擬證實，IDX可以有效地調(diào)節(jié)生物墨水的折射率，從而大幅減少由被包裹的細胞引起的光散射(約10倍)。在這里，展示了用HCD(1億細胞/ml)進行3D生物打印，制作分辨率為50 μm。免疫熒光圖像和RNA測序(RNA-seq)也驗證了健康和功能的3D工程組織可以使用這種方法制造。在生物墨水中加入IDX時，細胞的活力、增殖或表型沒有觀察到統(tǒng)計學(xué)上的顯著變化。本研究還證明，可以制備厚的預(yù)帶血管組織，其總尺寸為17 mm × 11 mm × 3.6 mm，血管通道直徑為250 ~ 600 μm，細胞密度為4000萬個細胞/ml。灌注培養(yǎng)14天后，觀察到這些組織的內(nèi)皮化和血管生成。

圖2 光學(xué)性質(zhì)和光能分布

本研究通過在生物打印機的工作波長（405 nm）下測量了包含 5% GelMA 和各種濃度的 IDX 的生物墨水的折射率，驗證了 IDX 可以有效地調(diào)整折射率。如圖 2所示，當 IDX 濃度從 20% 增加到 35% 時，生物墨水的折射率線性增加。本研究進一步驗證了適當濃度的 IDX 可以有效降低生物墨水的散射效應(yīng)。材料的散射效應(yīng)通常用散射系數(shù)、各向異性和折減散射系數(shù)來表征。本研究制備了包含 5% GelMA、4000 萬個細胞/ml 和各種 IDX 濃度的生物墨水，并使用結(jié)合蒙特卡羅模擬和粒子群優(yōu)化算法的方法來確定生物墨水在生物打印機工作波長（405 nm）下的散射特性。這些生物墨水的測量散射系數(shù)、各向異性和減少的散射系數(shù)如圖 2（B 至 D）所示。高散射系數(shù)和接近 1 的各向異性值表明載有細胞的生物墨水是高度光散射的，主要是前向散射。沒有調(diào)整折射率的生物墨水的散射系數(shù)為 11.76 mm-1，散射系數(shù)降低為 0.164 mm-1。通過使用 30% IDX 調(diào)整折射率，生物墨水的散射系數(shù)大幅降低至 1.377 mm-1，降低后的散射系數(shù)降低至 0.014 mm-1，這意味著這種方法可以將散射降低約 10 倍。通過仔細調(diào)整 IDX 的濃度，可以進一步減少散射。

圖3 生物相容性分析

為了驗證 IDX 與各種生物材料和細胞類型的生物相容性，本研究使用三種常用配方對薄板進行了生物打�。篏elMA 中的人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC)、甲基丙烯酸縮水甘油酯透明質(zhì)酸 (GMHA) 中的人雪旺細胞 (HSC) 和藻酸鹽甲基丙烯酸酯 (AlgMA) 中的 C2C12。由于理想的 IDX 濃度范圍在 20% 到 35% 之間變化，本研究比較了使用 0% 或 35% IDX 的 3D 打印組織。使用 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 測定法測量的代謝活性強度表明，在 7 天的培養(yǎng)過程中，所有三種類型的生物墨水中封裝的細胞呈指數(shù)增長。此外，與對照相比，使用 IDX 對細胞的代謝活性沒有統(tǒng)計學(xué)顯著影響，這意味著 IDX 不會阻礙細胞增殖（圖 3）。此外，本研究還使用活/死染色來表征細胞活力。GelMA 生物墨水中的 HUVEC 打印為 IDX 為 0 或 35% 的薄板�？傮w而言，在培養(yǎng)的第 1 天和第 7 天，大多數(shù)細胞對于 0% 和 35% IDX 樣本都是存活的。在 0% 和 35% IDX 之間沒有觀察到顯著的質(zhì)量差異，這意味著IDX 的摻入不會顯著影響細胞活力。

圖4 3D打印血管化可灌注厚組織

由于細胞誘導(dǎo)的光散射引起的密度-生存力-分辨率三難困境，以前使用基于光的方法對預(yù)血管化組織進行直接 3D 打印的研究通常局限于無/低細胞密度或制造分辨率差。本研究設(shè)計并3D打印了一個厚的（17 mm x 11 mm x 3.6 mm）預(yù)血管化組織結(jié)構(gòu)（圖 4），而且使用的是折射率匹配的生物墨水（包含 4000 萬個細胞/ ml）。中空血管通道的直徑范圍為 250 至 600 μm。HUVEC 和人真皮成纖維細胞 (HDF) 分別以 23 和 1700 萬個/ml 的密度封裝在 GelMA 生物墨水中。圖 4顯示了 3D 打印結(jié)構(gòu)的顯微計算機斷層掃描 (μCT) 圖像（透視圖和橫截面）和打印結(jié)構(gòu)的明場顯微圖像（頂視圖和橫截面）。在支架中觀察到空心通道，這意味著所需的復(fù)雜微觀結(jié)構(gòu)特征可以以高分辨率和高保真度打印在細胞化支架中。這證實了高密度、均勻混合的細胞被封裝在印刷結(jié)構(gòu)中。

2. 總結(jié)與展望
本研究在添加了 IDX 的 GelMA 生物墨水中實現(xiàn)了 50 μm 的分辨率，細胞密度為 1 億個細胞/ml。此外，能夠用細胞密度高達 2.25 億個細胞/ml的墨水3D打印 GelMA 圓柱體結(jié)構(gòu)（直徑 1.5 毫米，高度 1 毫米）而不會影響結(jié)構(gòu)完整性。這些 HCD 工程組織柔軟（楊氏模量約為 1 kPa）但穩(wěn)定，并且它們在操作過程中不會分解。雖然這種柔軟的結(jié)構(gòu)在獨立時難以操作，但如果印在蓋玻片上則很容易操作。雖然它們的細胞密度仍低于生理上觀察到的水平（1 至 30 億個細胞/ml），但該技術(shù)可同時實現(xiàn)具有 HCD、高活力和高分辨率的 3D 生物打印。該技術(shù)簡單明了且可推廣，可輕松應(yīng)用于大多數(shù)生物材料和細胞類型。這是朝著能夠制造功能性大規(guī)模、臨床可移植組織或器官邁出的重要一步，其中 HCD 和精細血管網(wǎng)絡(luò)是必不可少的。

文章來源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade7923