3D 打印骨化中心類器官的分而治之策略促進(jìn)快速骨愈合

來源：EFL生物3D打印與生物制造

當(dāng)前，臨界尺寸骨缺損的修復(fù)面臨延遲再血管化與再生困難的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)自體骨移植或人工移植物存在供體部位并發(fā)癥、感染及骨整合不佳等問題，永久合成支架也限制了血管化與骨生長。新興生物雜交方法雖使用可降解基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞自組織，但需高成本體外預(yù)培養(yǎng)及額外生長因子誘導(dǎo)，難以滿足臨床需求。  

浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/良渚實(shí)驗(yàn)室歐陽宏偉教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了骨化中心類器官（OCO），通過3D打印技術(shù)構(gòu)建內(nèi)核心骨形態(tài)發(fā)生-神經(jīng)營養(yǎng)球體與外鞘促血管生成神經(jīng)營養(yǎng)相的雙模塊結(jié)構(gòu)，利用“分而治之”策略實(shí)現(xiàn)骨缺損處的快速骨橋接。該研究以“Divide-and-conquer strategy with engineered ossification center organoids for rapid bone healing through developmental cell recruitment”為題發(fā)表在《Nature Communications》上，為解決臨界尺寸骨缺損修復(fù)難題提供了新途徑。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院特聘研究員張顯著為本文的第一作者，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院蔣煒、吳心宇碩士研究生為本文的共同第一作者。浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/良渚實(shí)驗(yàn)室歐陽宏偉教授為本文的通訊作者。

1. 通過堿性磷酸酶（ALP）染色、阿爾新藍(lán)（ARS）染色及實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）等方法，研究了CGRP與BMP-2在不同濃度組合下對MSCs成骨分化的影響。結(jié)果表明，CGRP（10⁻⁸ M）與生理劑量BMP-2（0.5 μg/mL）協(xié)同作用時(shí)，顯著提升ALPL、RUNX2等成骨基因表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)形成，且細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)、衰老標(biāo)記物減少。   

圖1. CGRP協(xié)同促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞與生理劑量BMP-2的成骨分化。

2. 利用數(shù)字光處理（DLP）3D打印技術(shù)，制備負(fù)載MSCs、CGRP和BMP-2的GelMA/HA-NB水凝膠微球，通過活/死染色、免疫熒光及RT-qPCR分析細(xì)胞行為。結(jié)果顯示，直徑400 μm的微球具有更高細(xì)胞存活率，且CGRP與BMP-2協(xié)同促進(jìn)MSCs在微球內(nèi)的成骨分化，RUNX2和OCN等標(biāo)記物表達(dá)顯著上調(diào)。

圖2. 基于3D打印的骨化中心類球體構(gòu)建及其細(xì)胞存活與成骨潛力。

3. 通過大鼠顱骨缺損模型，結(jié)合μ-CT掃描和Masson三色染色，比較OCO、雙模塊水凝膠（Vehicle）及混合MSCs與神經(jīng)營養(yǎng)因子（Hybrid）組的骨再生效果。結(jié)果表明，OCO組在4周和8周時(shí)均表現(xiàn)出更高的骨體積分?jǐn)?shù)、骨礦化密度及新骨-舊骨整合度，且形成蜂窩狀骨結(jié)構(gòu)及完整骨 marrow腔。   

圖3. OCO植入實(shí)現(xiàn)骨缺損處快速骨橋接與全層重建。

4. 通過HE染色、免疫熒光（CGRP、β-III tubulin、CD31等標(biāo)記）分析OCO植入后組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，OCO促進(jìn)軟骨樣組織形成并動態(tài)轉(zhuǎn)化為骨組織，同時(shí)誘導(dǎo)感覺神經(jīng)纖維（CGRP+）和血管（CD31+）侵入，伴隨COLX+肥大軟骨細(xì)胞及OCN+成骨細(xì)胞的有序分布。

圖4. OCO原位融合與成熟過程重現(xiàn)骨化中心發(fā)育中的神經(jīng)、血管與骨化協(xié)同作用。   

5. 通過單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）分析大鼠顱骨缺損修復(fù)2周后的組織細(xì)胞，利用UMAP降維與聚類分析。結(jié)果鑒定出15個(gè)細(xì)胞群，包括B/T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨譜系細(xì)胞（OLCs）等，其中OLCs在OCO組中比例顯著變化，為解析骨再生細(xì)胞機(jī)制提供基礎(chǔ)。   

圖5. 再生骨組織的單細(xì)胞圖譜揭示細(xì)胞異質(zhì)性，尤其是成骨譜系細(xì)胞。

6. 對OLCs進(jìn)行亞聚類分析，鑒定出9個(gè)亞群（如Has1+遷移成纖維細(xì)胞、Krt8+ SSCs等），結(jié)合基因功能富集與譜系發(fā)育分析。結(jié)果顯示，Krt8+ SSCs和Thy1+ SSCs作為主要干/祖細(xì)胞群，且不同亞群參與軟骨形成、骨祖細(xì)胞分化及纖維化等不同路徑。   

圖6. 單細(xì)胞RNA-seq揭示骨修復(fù)中成骨譜系細(xì)胞異質(zhì)性及緊密聯(lián)系。

7. 通過差異基因分析與GO富集，定義四個(gè)細(xì)胞社區(qū)（CC1-CC4），結(jié)合免疫染色驗(yàn)證其空間定位。結(jié)果表明，CC3（Krt8+ SSCs）和CC4（Thy1+ SSCs）主導(dǎo)再生骨組織，而CC1（Has1+成纖維細(xì)胞）在未治療組中廣泛分布，社區(qū)功能差異與骨再生/不愈合狀態(tài)相關(guān)。   

圖7. 骨修復(fù)過程中形成具有獨(dú)特轉(zhuǎn)錄特征與空間分布的四個(gè)OLC社區(qū)。

8. 通過scRNA-seq比較各組OLC亞群比例，結(jié)合免疫熒光染色（Krt8、Has1等），并利用機(jī)器學(xué)習(xí)模型分析跨物種數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，OCO組中Krt8+ SSCs比例顯著升高，Has1+遷移成纖維細(xì)胞減少，且Krt8+ SSCs與發(fā)育中骨組織的細(xì)胞特征高度相似。   

圖8. 骨再生過程中發(fā)育性Krt8+骨骼干細(xì)胞被促再生OCO優(yōu)先招募。

9. 整合人、鼠、大鼠的發(fā)育與再生scRNA-seq數(shù)據(jù)，通過HGBoost模型分析Krt8+ SSCs和Has1+ MFs的特征基因。結(jié)果表明，OCO誘導(dǎo)的骨再生中Krt8+ SSCs的分子特征與人類胚胎長骨發(fā)育中的細(xì)胞高度相似，而Has1+ MFs主要存在于損傷修復(fù)組織中。

圖9. 機(jī)器學(xué)習(xí)跨物種比較揭示骨再生中Krt8+ SSCs與發(fā)育骨組織的高度相似性。

研究結(jié)論
本研究表明，通過3D打印構(gòu)建的骨化中心類器官（OCO）采用“分而治之”策略，可實(shí)現(xiàn)臨界尺寸骨缺損的快速再生。OCO由內(nèi)核心骨形態(tài)發(fā)生-神經(jīng)營養(yǎng)球體與外鞘促血管生成神經(jīng)營養(yǎng)相組成，其原位融合與成熟過程伴隨神經(jīng)支配、血管化和骨化的協(xié)同發(fā)生，部分通過軟骨內(nèi)成骨途徑促進(jìn)骨修復(fù)。單細(xì)胞RNA測序分析顯示，OCO可調(diào)控成骨譜系細(xì)胞形成具有特定分子功能和空間分布的細(xì)胞社區(qū)，顯著促進(jìn)Krt8+骨骼干細(xì)胞（SSCs）擴(kuò)增并減少Has1+遷移成纖維細(xì)胞�？缥锓N機(jī)器學(xué)習(xí)比較證實(shí)，OCO誘導(dǎo)的骨再生中Krt8+ SSCs與發(fā)育骨組織的細(xì)胞組成高度相似。該研究為高效修復(fù)臨界尺寸骨缺損提供了基于發(fā)育生物學(xué)啟發(fā)的新策略。

文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-025-61619-y