蛋清用做生物墨水？改善3D打印支架的生物學

來源： EFL生物3D打印與生物制造

三維微擠壓生物打印在制造具有空間定義的細胞分布的分層結(jié)構(gòu)、功能性組織替代品方面引起了極大的興趣。盡管取得了相當大的進步，但仍然存在一些重大限制，例如缺乏合適的生物墨水，這些生物墨水將有利的細胞反應與高形狀保真度相結(jié)合。

為了解決這一局限性，來自德累斯頓工業(yè)大學的Michael Gelinsky的團隊創(chuàng)新性的設計了蛋清(EW)功能化的藻酸鹽-甲基纖維素(AlgMC)混合物的新型生物墨水。生物打印的AlgMC+EW構(gòu)造表現(xiàn)出出色的形狀保真度，而封裝的人間充質(zhì)干細胞(MSC)顯示出高打印后活力以及在基質(zhì)內(nèi)的粘附和擴散。

相關研究成果以“Egg white improves the biological properties of an alginate-methylcellulose bioink for 3D bioprinting of volumetric bone constructs”為題于2023年2月3日發(fā)表在《Biofabrication》上。

1. 不同EW濃度的低粘度Alg水凝膠中的細胞反應
為了研究EW對細胞反應的影響，制備了六種不同的Alg水凝膠組合物，其中 Alg 含量恒定為 3%（w/v），EW 的比例從 0-100% 不等�；�于這些生物墨水的載滿細胞的圓盤狀結(jié)構(gòu)是通過擠壓沉積法制造的（圖1A）。培養(yǎng) 1 天和 7 天后，通過活/死測定評估制造的載有細胞的圓盤的細胞相容性（圖1B），各組細胞存活率均達到80%以上。由此，EW 支持的生物墨水可以促進 MSC 在基于擠壓的支架中的活力。

圖1 3D打印支架及細胞存活率

此外，與第1天相比，細胞密度有所降低（圖2A）。相比之下，在 E40-H60 組中發(fā)現(xiàn)了MSC的交錯細胞骨架網(wǎng)絡，并且在孵育7天后也可以觀察到 E60-H40、E80-H20 和 E100-H20 組中的細胞附著和擴散（圖2A），即細胞可以在用 EW 修飾的Alg生物墨水中附著和擴散；然而，EW的濃度應超過40%才能產(chǎn)生顯著效果。為了進一步分析不同支架中的細胞形態(tài)，對培養(yǎng)7天后的細胞面積（細胞骨架染色的覆蓋面積）進行了定量測量（圖2C）；結(jié)果表明含有EW的Alg墨水可以促進MSC在凝膠中的附著和擴散，并且 EW 的量不應低于40%。

圖2 不同EW比例的擠壓Alg生物墨水中的細胞活力

2. 探索MSC在EW支持的藻酸鹽油墨中的活力和附著力，同時增強MC的印刷適性
由于帶有EW的Alg墨水（3%，w/v）的低粘度不允許3D打印具有足夠形狀保真度的線以形成多孔網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，這對于生物打印結(jié)構(gòu)中的開放孔隙率是強制性的，因此作者混合了Alg含MC的油墨，用于增強粘度和印刷適性。根據(jù)之前細胞反應結(jié)果，作者選擇E40-H60和E60-H40混合物（即40%和60% EW濃度）用作生物聚合物Alg和MC的溶劑。相關制備過程示意圖如圖3A所示，將MSC添加到不同的墨水中以制備生物墨水和擠壓結(jié)構(gòu)。

之后通過評估細胞活力和形態(tài)對制備的生物墨水中的細胞反應進行初步評估。在培養(yǎng)1天和21天后，通過活/死染色評估MSC在具有不同濃度EW和MC的擠壓圓盤結(jié)構(gòu)中的生存能力（圖3B）。從這些結(jié)果得出的結(jié)論是，與不含 MC 的 Alg 凝膠相比，細胞活力隨著 MC 的添加而降低。培養(yǎng)21天后，各組均能保持較高的細胞活力；此外，作者還發(fā)現(xiàn)細胞可以在結(jié)構(gòu)中附著和擴散（圖 3B）。

圖3 制備過程示意圖及細胞染色的代表性熒光顯微圖像

為了進一步研究細胞形態(tài)，在培養(yǎng)1天和21天后對細胞核和肌動蛋白細胞骨架進行熒光染色，捕獲的圖像如圖4A所示。60% EW組比40% EW組更成功地支持細胞生長，從細胞骨架的形態(tài)學分析來看，具有 60% EW 的組表現(xiàn)出更好的細胞粘附和擴散，可能是因為這些材料為 MSC 提供了更多的粘附位點和友好的微環(huán)境。根據(jù)細胞骨架染色后的顯微照片定量分析細胞面積顯示，60％EW組的細胞面積大于40％EW組(圖4C)。這些結(jié)果初步表明，具有60% EW的AlgMC生物墨水在生物打印結(jié)構(gòu)中具有良好細胞反應，表現(xiàn)優(yōu)于40% EW組。因此，具有60% EW的AlgMC生物墨水用于進一步的實驗。

圖4 不同比例的MC和EW的生物打印Alg-MC-EW結(jié)構(gòu)中MSC的細胞活力

3. 流變學特性
流變學特性是對糊狀生物材料的印刷適性具有決定性影響的物理化學參數(shù)，基于開發(fā)的油墨的生物學特性評估結(jié)果，油墨組合物 60-40(3-3)、60-40(3-6) 和 60-40(3-9) 的流變學特性為通過剪切斜坡和剪切恢復試驗進行研究。通過將 MC 濃度從 3% 增加到 9%，a在 0 到 100 s−1 的剪切速率范圍內(nèi)實現(xiàn)了粘度的穩(wěn)定增加，同時所有組也表現(xiàn)出出色的剪切稀化行為（圖5A）。

通常，較高的粘度會導致較高的印刷保真度，這意味著 MC 可以用作增強水凝膠油墨粘度并提高其印刷保真度的補充劑。結(jié)果表明，開發(fā)的油墨在暴露于交替的高剪切應力和低剪切應力時具有恢復其彈性的能力，這意味著它們具有良好的形狀保持特性，適用于基于擠出的印刷。此外，還可以發(fā)現(xiàn)高壓滅菌對制備的油墨的流變學性能沒有不利影響，因此可以看作是一種方便有效的海藻酸鹽和甲基纖維素滅菌方法。

圖5 添加細胞懸液前后的油墨流變學特性

4. 基于蛋清支持油墨的復雜3D結(jié)構(gòu)的可印刷性和構(gòu)建特性
通過手動制作圓盤狀支架來評估EW支持的生物墨水的可擠出性及其形成穩(wěn)定鏈的能力。在所有組中均觀察到良好的可擠出性，并且可以形成連續(xù)長絲（根據(jù)其特定粘度和擠出行為調(diào)整印刷壓力）。作者從流變測量、燈絲塌陷（圖6A）和融合測試（圖6B）的結(jié)果得出結(jié)論，60-40(3-9) 和 HBSS(3-9) 墨水在 3D 支架制造中表現(xiàn)出出色的可印刷性和形狀保真度。作者進一步探索了包含具有挑戰(zhàn)性的幾何特征的復雜體積結(jié)構(gòu)的3D打印，以研究這種新型電子戰(zhàn)墨水的自支撐能力（圖6C）。所有結(jié)構(gòu)都保持其形狀和設計特征，具有開放和相互連接的大孔，這對于細胞輸送氧氣和營養(yǎng)以及代謝副產(chǎn)物非常重要。此外，更復雜、體積更大的結(jié)構(gòu)具有更具挑戰(zhàn)性的特征（例如打印了解剖形狀、動物模型和曲線交織多孔結(jié)構(gòu)）（圖6D-H）。

圖6 復雜3D結(jié)構(gòu)的可印刷性和構(gòu)造特征

5. 3D打印AlgMC+EW支架的細胞相容性
為了評估3D打印AlgMC+EW墨水的接種hTERT-MSC的細胞活力和粘附行為，將支架培養(yǎng)1、4和7天，并對活/死細胞活力進行染色。支架上活/死染色細胞的熒光圖像、細胞活力和粘附率的定量分析如圖7A-C所示。AlgMC+EW 支架中的細胞密度高于AlgMC組（圖7C），表明AlgMC+EW支架為MSC提供更具吸引力的環(huán)境。AlgMC+EW 支架上的細胞則相反，明顯擴散并附著在支架表面（圖7A），這也導致粘附率增加（圖7C）。與此同時，幾乎所有的活細胞都顯示出足夠的粘附水平，它們散布在支架的表面并伸展以與相鄰的細胞連接，表現(xiàn)出絲狀偽足樣的延伸。此外，計算出的細胞粘附率進一步增加，明顯高于AlgMC組（圖7C）。

圖7 無細胞AlgMC+EW支架的制備及3D打印支架的細胞相容性評價

6. AlgMC+EW支架中人原代前成骨細胞(hOB)的成骨分化
為了進一步研究 EW 對成骨分化的影響，將從骨關節(jié)炎患者的人股骨頭中分離出來的hOB懸浮在 AlgMC + EW 生物墨水中以制造載有 hOB 的支架；同時，載有hOB的普通 AlgMC 支架作為對照組進行了生物打印（圖8A）。AlgMC+EW墨水中的大部分hOB顯示出具有高細胞密度的細長形態(tài)，而在AlgMC支架中仍觀察到球形。此外，對支架中的細胞核和細胞骨架進行熒光染色，以進一步觀察第1、21和28天的細胞形態(tài)。而AlgMC支架中的細胞仍然小而圓，只有少數(shù)細胞表現(xiàn)出輕微的細長細胞形態(tài)；類似的結(jié)果一直保持到第28天。此外，圖8D說明AlgMC+EW 支架內(nèi)的細胞數(shù)量明顯高于AlgMC。這些結(jié)果表明 EW 具有促進 hOB 細胞粘附、擴散、遷移和增殖的功能（圖8）。在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，這種效果甚至會增強，這可能是由于基于EW的生物墨水中存在蛋白質(zhì)，它為細胞附著提供了整合素結(jié)合基序。

圖8 3D支架的制備過程以及AlgMC和AlgMC+EW支架的細胞表征

綜上，本文開發(fā)了一種新型生物墨水，其優(yōu)化配方由海藻酸鹽、甲基纖維素和蛋清 (EW) 組成，它結(jié)合了良好的印刷適性和高形狀保真度以及良好的細胞反應。為了研究添加EW對成骨分化的影響，在AlgMC+EW生物墨水中對人原代前成骨細胞(hOB)進行了生物打印。它們顯示出hOB的高活力(93.7 ± 0.2 %) 和隨培養(yǎng)時間的粘附，以及生物墨水內(nèi)的增殖和遷移。與無 EW 支架相比，部分成骨標記物（IBSP、BGLAP）的基因表達也得到了促進。

文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb8dc