《AHM》：擠出式生物3D打印實(shí)現(xiàn)均勻表皮層工程

來源： EngineeringForLife

為了重建一個(gè)理想的全層皮膚模型，基底角質(zhì)形成細(xì)胞必須以融合的單層形式分布在真皮上。然而，目前可用的皮膚擠出式生物打印方法在產(chǎn)生空氣暴露的細(xì)胞單層時(shí)受到限制，因?yàn)榧?xì)胞被封裝在生物墨水中。北京理工大學(xué)高戈副研究員和韓國浦項(xiàng)科技大學(xué)Dong-Woo Cho、釜山大學(xué)Byoung Soo Kim第一次通過使用犧牲明膠輔助擠出式生物打印復(fù)制均勻和分層的表皮層研究。對(duì)流變特性、可打印性、細(xì)胞活力和初始角質(zhì)形成細(xì)胞粘附的實(shí)驗(yàn)分析表明，最佳明膠生物膠濃度為4 wt.%。用于實(shí)現(xiàn)融合的角質(zhì)形成細(xì)胞層的生物打印明膠結(jié)構(gòu)的適當(dāng)厚度為400 μm。建議的策略產(chǎn)生一個(gè)均勻的角質(zhì)形成細(xì)胞單層，在整個(gè)中央和外周區(qū)域有緊密的連接，而人工播種產(chǎn)生不均勻的細(xì)胞聚集和空位。這些結(jié)果影響基因表達(dá)，表現(xiàn)出表皮分化傾向。最后，將明膠輔助的角質(zhì)形成細(xì)胞生物打印到由甲基丙烯�；�明膠和真皮衍生的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)組成的真皮上，建立全層皮膚模型。因此，這種策略可以顯著改善表皮的分化/分層。本研究結(jié)果表明明膠輔助方法有利于重建可靠的全層皮膚模型，具有顯著的一致性。

相關(guān)研究內(nèi)容以“Engineering of Uniform Epidermal Layers via Sacrificial Gelatin Bioink-Assisted 3D Extrusion Bioprinting of Skin”為題于2023年8月3日發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》。

圖1 本研究中應(yīng)用的總體策略和工作流程示意圖

皮膚由真皮層和表皮層組成，通常被稱為全層皮膚（圖1A）。明膠的一個(gè)獨(dú)特特征是它的熱敏性，這允許它在低溫下形成物理鍵，同時(shí)可在高溫下溶解（圖1B）。通過評(píng)估流變學(xué)特性、打印能力、細(xì)胞活力和初始角質(zhì)形成細(xì)胞粘附分析結(jié)果，研究了犧牲明膠生物墨水的最佳條件（1−12wt%）（圖1C）。與人工播種方法相比，本研究使用已建立的明膠生物墨水的新策略成功地在整個(gè)中心和外周區(qū)域創(chuàng)建了一個(gè)統(tǒng)一的角質(zhì)形成細(xì)胞單層，具有緊密連接蛋白（E-鈣粘蛋白）（圖1D）。當(dāng)應(yīng)用犧牲明膠輔助擠出式生物打印時(shí)，無論人類真皮成纖維細(xì)胞（HDF）的ECM成分如何，真皮（真皮衍生脫細(xì)胞ECM）或甲基丙烯酰明膠)中的表皮的形成和表皮分化標(biāo)記物的上調(diào)（圖1E）。這些結(jié)果表明，本研究所提出的犧牲明膠輔助擠出式生物打印策略是一種很有前途的生物制造技術(shù)，可以穩(wěn)定地再現(xiàn)具有優(yōu)越的重復(fù)性的大規(guī)模生產(chǎn)。

圖2 基于不同溫度下的流變學(xué)分析的不同濃度（1−12重量%）明膠基生物墨水的可打印性試驗(yàn)

在10到37℃的溫度下，使用不同濃度的明膠生物墨水（1−12wt%）研究了流變特性（圖2A）。在10℃下，1 wt%明膠生物墨水的粘度為8.2Pa·s，隨著溫度的升高而迅速下降，且在相同的溫度范圍內(nèi)，較低濃度的明膠生物墨水具有較高的粘度分布。在10、15、20和25℃下對(duì)其打印性進(jìn)行分析，根據(jù)其視覺擠出式形式將結(jié)果分為以下四種類型：泄漏、規(guī)則、不規(guī)則和不可擠出式（圖2Bi）。根據(jù)可打印性試驗(yàn)和流變粘度結(jié)果，根據(jù)各自的擠出式形式建立了粘度范圍（圖2Bii）。通過水平放置含有8%明膠生物墨水的小瓶來觀察不同的擠出式形式，可以直觀地觀察粘性（圖2C）。通過調(diào)節(jié)打印溫度，研究了使用不同擠出式類型擠出式明膠生物墨水所需的最小壓力，泄漏式生物墨水在沒有氣動(dòng)壓力的情況下在噴嘴尖端形成一個(gè)液滴，表明無法精確控制充滿細(xì)胞的生物墨水的數(shù)量；在規(guī)則的擠出溫度范圍內(nèi)，明膠生物墨水可以在12 kPa處以果凍狀擠出（圖2D）。通過為每種打印類型創(chuàng)建三個(gè)網(wǎng)格圖案的方塊，評(píng)估了可打印擠出式類型的打印精度，即規(guī)則類型和不規(guī)則類型，當(dāng)明膠生物墨被有規(guī)律地?cái)D出式時(shí)，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)之間沒有顯著差異。（圖2E）。使用兩種可打印的明膠生物墨水，通過逐層打印的方式獲得了固體和多孔的3D結(jié)構(gòu)（圖2Fi、ii）。以上結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)打印溫度，可以精確地調(diào)整明膠基生物墨水的流變特性。

圖3 利用犧牲明膠生物墨水建立擠出式生物打印條件，以產(chǎn)生均勻和融合的細(xì)胞高效的角質(zhì)形成細(xì)胞單層

生物墨水的粘度升高可能會(huì)損害細(xì)胞，因?yàn)樵诖┩竾娮鞎r(shí)會(huì)發(fā)生過度的剪切應(yīng)力（圖3A）。為了評(píng)估規(guī)則和不規(guī)則擠出式類型對(duì)細(xì)胞活力的影響，將人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HEKs）封裝在4wt%和8wt%的明膠生物墨水中，然后在上述溫度下進(jìn)行擠出式，以產(chǎn)生規(guī)則和不規(guī)則的擠出式（圖3Bi）�；�/死染色定量結(jié)果顯示，常規(guī)型擠出式的大部分HEKs具有較高的細(xì)胞活力（圖3Bii）。對(duì)4wt%和8wt%的明膠生物墨水進(jìn)行流變學(xué)評(píng)估，以確定其在溫度從10°C升高到37°C時(shí)的流變學(xué)特性（圖3C）。結(jié)果表明生物墨水表現(xiàn)出流體主導(dǎo)的特性。通過F-actin染色，在培養(yǎng)板上的明膠輔助擠出式生物打印觀察了HEKs的初始粘附，并將其與在2D底物上培養(yǎng)的組進(jìn)行了比較（圖3Di、ii）。使用常規(guī)擠出式方法，將明膠結(jié)構(gòu)的厚度從100μm增加到1200 μm，擠出式HEK-4wt%明膠生物墨水，以獲得融合的角質(zhì)形成細(xì)胞單層；z-堆疊共聚焦結(jié)果顯示，> 600 μm的明膠結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了多層HEK聚集體的形成（圖3E）。因此，確定HEK內(nèi)嵌明膠結(jié)構(gòu)的最佳厚度為400 μm，確保形成均勻的角質(zhì)形成細(xì)胞單層。利用明膠的熱敏性，本研究成功地建立了犧牲明膠輔助擠出式生物打印形成融合的角質(zhì)形成細(xì)胞單層的條件。

圖4 犧牲明膠輔助擠出式生物打印與人工播種方法的比較

基于已建立的明膠輔助擠出式生物打印條件，將犧牲明膠生物墨水中的HEKs均勻擠出式在3D打印的合成聚合物15 mm x 15 mm方形框架中（圖4A）。為了深入分析它們的功能附著和分布，使用共聚焦顯微鏡捕獲了中心（圖4B）和外圍（圖4C）區(qū)域的表面圖像。結(jié)果表明，用明膠生物墨水生物打印的HEKs在整個(gè)表面均勻地附著，沒有空隙；而人工播種的HEKs在兩個(gè)區(qū)域都留下了幾個(gè)未附著的空間。在使用常規(guī)方法時(shí)可以觀察到部分沒有細(xì)胞的空白區(qū)域（圖4D）。使用具有代表性的分層表皮早期分化標(biāo)記物，如角蛋白1（KRT1）、外皮蛋白（IVL）和兜甲蛋白（LOR）來評(píng)估基因表達(dá)，結(jié)果顯示，與人工組相比，生物打印組的所有基因均顯著上調(diào)（圖4E），表明通過明膠生物墨水形成的均勻角質(zhì)形成細(xì)胞單層可以促進(jìn)整個(gè)真皮室表皮的形成。生物打印組顯示E-鈣粘蛋白的基因表達(dá)水平顯著增加（圖4F），表明整個(gè)表面HEKs之間細(xì)胞間連接的形成增強(qiáng)。使用ELISA對(duì)人工和生物打印方法擠出式的分離HEKs中，緊密連接蛋白的水平進(jìn)行定量分析，包括occludin、zonula occludens-1（ZO-1）和claudin-1，結(jié)果顯示生物打印組緊密連接蛋白顯著高于手動(dòng)組（圖4G)。

圖5 使用所提出的犧牲明膠輔助的3D皮膚擠出式生物打印技術(shù)制造均勻的表皮層

如圖5A所示，按照體外皮膚工程的典型過程重建了生物打印的皮膚模型。5天后，嵌入的HDFs均顯示出較高的細(xì)胞活力和穩(wěn)定的形態(tài)（圖5B）。組織學(xué)圖像顯示，所有使用常規(guī)或擠出式生物打印方法創(chuàng)建的皮膚模型，在氣液界面（ALI）培養(yǎng)10天后，都顯示出表皮分層（圖5C），表明HEKs成功分化。使用本研究中的策略創(chuàng)建的全層皮膚模型在基于GelMA-和D-dECM的皮膚等效物上的表皮厚度分別為74.4 ± 3.5和98.4 ± 4.1 μm，是手動(dòng)組的兩倍（圖5D）。生物打印表皮的基因表達(dá)比較結(jié)果顯示，與人工播種法誘導(dǎo)的表皮相比，具有代表性的分化標(biāo)志物，包括角蛋白19、角蛋白10和IVL的水平顯著升高（圖5E）。這些標(biāo)記物是角質(zhì)形成細(xì)胞分化和成熟的指標(biāo)，在生物打印表皮中的上調(diào)表明了一個(gè)更先進(jìn)和更有組織的分化過程。使用具有代表性的早期（IVL）和晚期（KRT10）表皮分化標(biāo)記物的共聚焦圖像顯示，與皮膚工程中使用的傳統(tǒng)人工播種方法相比，明膠-生物墨水輔助生物打印方法表現(xiàn)出更有組織的表皮結(jié)構(gòu)（圖5F）。為了評(píng)估表面潤濕性，測(cè)量了無表皮的真皮腔室（無表皮）和由人工和生物打印方法創(chuàng)建的皮膚模型的接觸角，當(dāng)未形成表皮時(shí)，生物打印誘導(dǎo)的表皮角度明顯高于人工打印誘導(dǎo)的表皮角度（圖5G）。與沒有表皮的結(jié)構(gòu)相比，手工皮膚模型的阻力顯著增加（圖5H）。此外，還研究了使用70 kDa右旋糖酐溶液處理1h后的滲透性，結(jié)果表明，無表皮組的右旋糖酐溶液滲透速度明顯快于表皮層狀的全層皮膚模型（圖5I）。綜上，生物打印皮膚模型的右旋糖酐擴(kuò)散水平明顯低于手動(dòng)模型，表明生物打印誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞間連接良好，有效地阻止了水分子的擴(kuò)散。

本研究成功地證明了犧牲明膠輔助3D皮膚擠出式生物打印是一種很有前途的技術(shù)，用于重建可靠的全層皮膚模型，具有優(yōu)越的大規(guī)模生產(chǎn)，且確定了明膠生物墨水的最佳濃度，并建立了擠出式生物打印條件，以均勻地覆蓋3D真皮在一個(gè)融合的細(xì)胞單層。最后驗(yàn)證了與人工播種模型相比，人工明膠輔助的3D皮膚擠出式生物打印策略顯著改善了表皮的分化和分層。

本文強(qiáng)調(diào)了利用犧牲明膠生物墨水的3D皮膚擠出式生物打印技術(shù)作為工程先進(jìn)皮膚模型的可行選擇，可用于各種皮膚和臨床應(yīng)用，包括藥物測(cè)試、疾病建模、毒性篩選和個(gè)性化醫(yī)療。此外，本研究中的方法可能提供一種替代動(dòng)物測(cè)試，并提供更多的預(yù)測(cè)結(jié)果。未來的研究可以通過研究3D生物打印皮膚模型的長期穩(wěn)定性和功能，并擴(kuò)大該技術(shù)的應(yīng)用范圍，進(jìn)一步改進(jìn)目前的工作。

文章來源：

https://doi.org/10.1002/adhm.202301015