UMC Utrecht為活體組織制備提出了新的體積生物打印解決方案

導(dǎo)讀：3D生物打印是以活體細(xì)胞和組織為原材料進(jìn)行打印的新興技術(shù)，科學(xué)家希望有朝一日可以通過這項(xiàng)技術(shù)從患者自己的細(xì)胞中培養(yǎng)器官，以此來解決器官供體短缺的問題。然而，打印活組織和細(xì)胞極其復(fù)雜，需要克服許多障礙才能實(shí)現(xiàn)。

2023年6月11日，南極熊獲悉，UMC Utrecht公司最近開發(fā)了三種新的體積生物打印解決方案，它們將推動(dòng)生物打印技術(shù)的發(fā)展，使其更具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

體積生物打印技術(shù)的興起

提及3D 生物打印，人們首先想到的是經(jīng)典的塑料絲擠出式3D 打印方法，即熔融沉積建模（FDM）。這種方打印法這在過去 15 年左右變得流行，如今這種低成本打印機(jī)已被廣泛使用。原則上，應(yīng)該可以用不同種類的細(xì)胞代替塑料絲材，從而打印出生物功能組織。但要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，就必須制造出高度精細(xì)和差異化的組織：即使是一立方毫米的器官組織也需要毛細(xì)血管，因此如果我們想創(chuàng)造我們需要的功能性組織，打印機(jī)的門檻需要很高才可以實(shí)現(xiàn)在臨床規(guī)模上的應(yīng)用。

隨著生物墨水的發(fā)展，擠壓式3D生物打印成為可能。新的噴嘴、營(yíng)養(yǎng)墨水和預(yù)制支架使細(xì)胞更容易在這個(gè)過程中存活下來。通過同時(shí)使用各種墨水，可以沉積不同種類的細(xì)胞，從而創(chuàng)造出組織。但是，逐層打印仍然需要很長(zhǎng)時(shí)間，多立方厘米的物體需要幾個(gè)小時(shí)，細(xì)胞很可能在此過程中死亡。此外，擠壓打印需要能夠承受重力，因此墨水需要堅(jiān)固，這意味著它們對(duì)細(xì)胞不是很友好。

為了克服這種緩慢且依賴于重力的過程，生物打印也提出了采用體積打印的模式。在此過程中，帶有特殊凝膠的旋轉(zhuǎn)小瓶暴露在激光下。激光照射到哪里，光敏凝膠就會(huì)迅速凝固。這意味著通過激光 3D 光重建，可以在幾秒鐘內(nèi)創(chuàng)建多個(gè)立方厘米的復(fù)雜形狀�，F(xiàn)在，雖然這解決了速度和重力的問題，但它也有其自身的缺點(diǎn)。以這種方式，這些光敏凝膠只能包含懸浮的細(xì)胞，因此很難控制哪種類型的細(xì)胞最終會(huì)在哪里，以及目標(biāo)區(qū)域內(nèi)有多少細(xì)胞很難控制。而且由于凝膠很硬，細(xì)胞很難移動(dòng)、伸展和相互流通，而這對(duì)于組織的形成甚至功能至關(guān)重要。

在烏得勒支再生醫(yī)學(xué)中心，研究人員一直在努力克服這些挑戰(zhàn)，下面討論的論文分別解決了上述挑戰(zhàn)的一部分。

在打印樣品中創(chuàng)建生物功能區(qū)域

體積生物打印技術(shù)可以在幾秒鐘內(nèi)打印出幾厘米大小的物體，為細(xì)胞打印提供了多種可能性。該過程的速度與凝膠的細(xì)胞友好性相結(jié)合是巨大的優(yōu)勢(shì)。然而，當(dāng)打印完成后，細(xì)胞可能不會(huì)準(zhǔn)確地放置在需要它們的位置，也不可能改變凝膠來幫助細(xì)胞的發(fā)育、生長(zhǎng)或特化以產(chǎn)生功能性組織。因此，克服這個(gè)障礙很重要：在我們的身體中，細(xì)胞知道去哪里和留在哪里，跟隨它們?cè)谔囟▍^(qū)域或組織中感知到的信號(hào)。

為打印凝膠添加功能

為了能夠在初始打印過程后對(duì)打印品進(jìn)行化學(xué)改性，研究人員研究了凝膠的孔隙率，以及其中與凝膠中其他分子結(jié)合的化合物。論文的第一作者 Marc Falandt 解釋說：“通過這種技術(shù)，可以在幾分鐘內(nèi)以高空間分辨率將生物分子移植到我們的打印結(jié)構(gòu)上。首先，我們用體積打印機(jī)打印基于明膠的結(jié)構(gòu)，然后通過將這些結(jié)構(gòu)注入生物分子和光引發(fā)劑，我們可以在明膠結(jié)構(gòu)內(nèi)創(chuàng)建復(fù)雜的 3D 模型。這種方法使我們能夠?qū)οＭ�捕獲生物分子的位置進(jìn)行三維控制，這在以前不可能的事情�！�

通過給細(xì)胞一張化學(xué)圖來幫助細(xì)胞找到它們的路

創(chuàng)新后的體積打印模式，可以將生長(zhǎng)因子或生物活性蛋白“涂”在任何所需的 3D 形狀中。例如，引導(dǎo)血管方向和形成的信號(hào)分子可以以這樣一種方式放置，即它們創(chuàng)建一條軌跡，僅在 3D 打印對(duì)象內(nèi)部需要的位置和時(shí)間吸引新血管。

然后，這些信號(hào)可以吸引正確的細(xì)胞，或幫助干細(xì)胞發(fā)揮其再生潛能。Falandt表示：“這項(xiàng)工作真正邁出了開發(fā)和表征智能材料的第一步，這些材料允許在三維空間中進(jìn)行生化編輯。結(jié)合快速體積生物打印技術(shù)，這種方法非常有希望用于創(chuàng)建可以指導(dǎo)細(xì)胞行為和發(fā)育的生物制造支架。它可以讓我們用我們的 3D 生物打印來密切模擬天然組織和器官的復(fù)雜生化環(huán)境。

用于打印電池的顆粒狀凝膠

對(duì)于成功制造的組織，打印的細(xì)胞需要精心呵護(hù)，才能在成品中存活并茁壯成長(zhǎng)。如果它們要形成一個(gè)功能性組織，它們就需要能夠生長(zhǎng)、移動(dòng)并相互交流。

研究人員已經(jīng)嘗試了各種打印策略來解決這個(gè)問題，它們各有利弊。在 3D 擠壓打印中，可以沉積多種類型的大量細(xì)胞，但這個(gè)過程需要很長(zhǎng)時(shí)間，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械應(yīng)力并且依賴于重力——所有這些都不利于細(xì)胞的存活和功能。通過快速體積生物打印，速度和重力可能已經(jīng)得到解決，但這里的挑戰(zhàn)是細(xì)胞隨機(jī)分布在樹脂中且數(shù)量較少，并且由于最終打印由固體樹脂組成，因此細(xì)胞無法正常移動(dòng)和交流。

生物打�。篖evatoLab，UMC Utrecht，根據(jù) Creative Commons CC-BY 4.0 許可條款轉(zhuǎn)載 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。139 版權(quán)所有 2019，Wiley-VCH 出版 (https:/ /doi.org/10.1101/2023.05.17.541111)

創(chuàng)建一個(gè)顆粒狀的微世界

為了解決這個(gè)問題，用于生物打印的材料必須提供允許細(xì)胞自組織和通信的環(huán)境。雖然這通�？梢酝ㄟ^軟水凝膠實(shí)現(xiàn)，但確保這些材料的高打印分辨率和形狀保真度仍然是一個(gè)關(guān)鍵瓶頸，尤其是在使用傳統(tǒng)的逐層制造技術(shù)時(shí)。

論文第一作者 Davide Ribezzi 探索了使用顆粒樹脂來克服這些挑戰(zhàn)，相關(guān)研究結(jié)果以題為“”的論文被發(fā)表在《bioRxiv》期刊上，撰稿人為Davide Ribezzi, MarièmeGueye, Sammy Florczak等人。

相關(guān)論文鏈接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.05.17.541111v1

Ribezzi 說：“顆粒凝膠基本上是由緊密堆積在一起的凝膠微粒構(gòu)成的。雖然每個(gè)微粒都具有與其散裝水凝膠對(duì)應(yīng)物相當(dāng)?shù)奶匦裕�但可以通過設(shè)計(jì)和定制填充的微凝膠顆粒以增加豐富的功能特性。因此，利用顆粒生物材料是一種很有前途的策略，可以解決打印過程中與大塊細(xì)胞封裝和材料可加工性相關(guān)的缺點(diǎn)�！�

Bioprinting (3) en (4)：LevatoLab，UMC Utrecht，根據(jù)知識(shí)共享 CC-BY 4.0 許可條款轉(zhuǎn)載 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。139 版權(quán)所有 2019，出版商威利-VCH (https://doi.org/10.1002/adma.202300756)

結(jié)合不同的打印策略

顆粒狀樹脂確實(shí)讓研究人員能夠?qū)�擠出和體積打印結(jié)合起來。使用擠壓打印，某些細(xì)胞或其他化學(xué)物質(zhì)可以專門沉積在樹脂中。這種方法實(shí)現(xiàn)了體積打印速度與擠出打印精度之間的平衡。凝膠在打印噴嘴周圍移動(dòng)，就像奶油凍包圍手指一樣，因此細(xì)胞可以快速放置在多層中，而不必?fù)?dān)心結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度。然后，體積打印可以通過在擠壓?jiǎn)卧�周圍�?chuàng)建和細(xì)化形狀來完成該過程。

但這個(gè)過程并非沒有挑戰(zhàn)。Ribezzi聲稱：“處理生物材料總是需要大量的關(guān)注和精心的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。但在我們的研究中，我們利用了微凝膠的熱特性，可以精確調(diào)整機(jī)械和光學(xué)特性。這轉(zhuǎn)化為嵌入細(xì)胞感知的可調(diào)刺激。然而，這種更高精度的調(diào)整在打印過程中需要更高程度的關(guān)注和精確度�！�

更多生物活性

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，顆粒狀樹脂在打印后具有更多的生物活性，大大優(yōu)于固體凝膠。在被打印到樹脂中后的八天內(nèi)，干細(xì)胞能夠擴(kuò)散得更多，內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生更多的連接，神經(jīng)元樣細(xì)胞之間的連接也更多。

Ribezzi 進(jìn)一步評(píng)論說：“對(duì)于未來的研究，我們?cè)O(shè)想了從不同材料中獲得的微凝膠的混合甚至局部圖案化。它將使我們能夠創(chuàng)建具有獨(dú)特特性的復(fù)合結(jié)構(gòu)，例如藥物的生物活性載體。這些工具將提高組織功能，并為組織工程、再生醫(yī)學(xué)和工程生物材料的新興領(lǐng)域開辟更多機(jī)會(huì)�！�

Bioprinting(3) en (4)：LevatoLab，UMCUtrecht，根據(jù)知識(shí)共享 CC-BY 4.0 許可條款轉(zhuǎn)載(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。139 版權(quán)所有 2019，出版商威利-VCH (論文鏈接：https://doi.org/10.1002/adma.202300756)

功能性血管的生物打印技術(shù)

體積生物打印是一種快速技術(shù)，可使細(xì)胞在打印過程中存活下來。然而，由于這種類型的打印是在對(duì)細(xì)胞友好的凝膠中完成的，因此產(chǎn)生的打印品在結(jié)構(gòu)上不是很健全。對(duì)于必須能夠承受高壓和彎曲的打印血管來說，這是一個(gè)問題。出于這個(gè)原因，研究人員開始嘗試體積生物打印和熔化電寫的整合。

熔體電寫是一種高度精確的 3D 打印類型，它通過引導(dǎo)熔融（可生物降解）塑料的細(xì)絲來工作。它能夠生產(chǎn)出機(jī)械強(qiáng)度高且能夠承受力的復(fù)雜支架。這里的缺點(diǎn)是它們不能直接在其中打印電池，因?yàn)樯婕案邷�。因此，這里使用體積生物打印是為了實(shí)現(xiàn)將載有細(xì)胞的凝膠固化到支架上。

這項(xiàng)研究以題為“Volumetric Printing across MeltElectrowritten Scaffolds Fabricates Multi-Material Living Constructs withTunable Architecture and Mechanics/熔體電寫支架上的體積打印可制造具有可調(diào)架構(gòu)和力學(xué)的多材料活體結(jié)構(gòu)”的論文被發(fā)表在《Advanced Materials》期刊上。論文撰稿人為GabrielGrößbacher, Michael Bartolf-Kopp, Csaba Gergely等人。

相關(guān)論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202300756

整合電子直寫和體積打印技術(shù)

這一過程從使用熔體電寫創(chuàng)建管狀支架開始。然后將其浸入裝有光敏凝膠的小瓶中，并放置在體積生物打印機(jī)中。原則上，打印機(jī)的激光可以選擇性地固化位于支架內(nèi)、支架上和/或周圍的凝膠。

本論文的第一作者 Gabriël Größbacher 說：“為了做到這一點(diǎn)，我們必須將支架放在小瓶的正中央，任何偏離中心的地方都意味著體積打印會(huì)被抵消。我們通過在安裝在小瓶上的心軸上打印支架，設(shè)法將其完美居中�！�

在這項(xiàng)研究中，Größbacher 及其同事測(cè)試了不同厚度的支架。最后，他們還測(cè)試了生物打印凝膠的各種放置方式。這些凝膠可以放置在支架的內(nèi)側(cè)、腳手架本身內(nèi)部或外部。通過使用兩種不同標(biāo)記的干細(xì)胞，該團(tuán)隊(duì)能夠打印出具有兩層干細(xì)胞的原理驗(yàn)證血管，并在中心種植上皮細(xì)胞以覆蓋血管腔。

從試管到功能性容器

這項(xiàng)設(shè)計(jì)還可以允許在打印品的側(cè)面打孔，從而有可能控制血管的滲透性，使血液發(fā)揮其功能。最后，研究人員還創(chuàng)造了更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，如分叉血管，甚至是帶有靜脈瓣膜的血管，這些靜脈瓣膜可維持單向流動(dòng)。

Größbacher表示：“這是對(duì)原理研究的證明。我們現(xiàn)在需要做的是用作為真實(shí)血管一部分的功能細(xì)胞替換干細(xì)胞。這意味著在上皮細(xì)胞周圍添加肌肉細(xì)胞和纖維組織。我們現(xiàn)在的目標(biāo)是打印功能性血管�！�

雖然這些創(chuàng)新為推動(dòng)生物打印提供了有趣的選擇，但如果它們可以結(jié)合和擴(kuò)展，效果會(huì)最好。研究小組組長(zhǎng) Riccardo Levato 表示：“能夠?qū)⑸�物活性分子打印成使用顆粒狀凝膠的打印品，這意味著細(xì)胞可以更好地利用分子信息，并與鄰近的細(xì)胞一起生長(zhǎng)發(fā)育成組織�！�