清華《AFM》：3D打印載細(xì)胞的高保真微凝膠雙相生物墨水！

來(lái)源：材料科學(xué)與工程

生物打印因其能夠精確地將細(xì)胞和材料(即生物墨水)沉積到3D復(fù)雜結(jié)構(gòu)中而引起人們的極大興趣，在工程體外生命系統(tǒng)中的應(yīng)用可用于疾病建模和組織再生。到目前為止，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種生物打印技術(shù)，例如噴墨生物打印和基于數(shù)字光處理(DLP)的生物打印。其中，最常見(jiàn)的方式是擠壓生物打印，其中生物墨水需要擠壓然后快速穩(wěn)定。3D擠壓生物打印的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是生物墨水的數(shù)量有限，這些墨水滿足了具有必要流變特性的適印性和具有所需微環(huán)境的功能的相反要求。

來(lái)自清華大學(xué)的學(xué)者通過(guò)開(kāi)發(fā)一種通用策略來(lái)解決這一限制，該策略用于配制基于細(xì)胞的微凝膠(MB)生物墨水。MB生物油墨包括兩個(gè)組分，即緊密堆積狀態(tài)的微凝膠為擠壓生物印刷提供優(yōu)異的流變性能，以及形成第二聚合物網(wǎng)絡(luò)以將微凝膠整合在一起的水凝膠前體，從而提供印刷后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。這一策略可以將一系列水凝膠打印成形狀保真度高的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。MB生物油墨具有極好的機(jī)械可調(diào)性而不會(huì)影響印刷性能，并且具有超強(qiáng)的彈性和卓越的循環(huán)壓縮和拉伸耐久性。此外，MB生物墨水的微凝膠和水凝膠前體可以包裹不同類型的細(xì)胞，共同創(chuàng)造一個(gè)微尺度的異質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境。利用MB生物墨水對(duì)肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行空間構(gòu)圖，成功地誘導(dǎo)了細(xì)胞的重組和血管化，從而增強(qiáng)了肝功能。本文提出的MB生物墨水?dāng)U展了現(xiàn)有生物墨水的調(diào)色板，并為組織工程和軟機(jī)器人等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用打開(kāi)了無(wú)數(shù)機(jī)會(huì)。相關(guān)文章以“3D Printing of Cell-Laden Microgel-Based Biphasic Bioink with Heterogeneous Microenvironment for Biomedical Applications”標(biāo)題發(fā)表在Advanced Functional Materials。

論文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202109810

圖1。負(fù)載細(xì)胞的MB生物墨水的制造和3D打印。a)水凝膠生物墨水和MB生物墨水示意圖。b)使用MB生物墨水的3D打印網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。c)MB生物墨水，以微凝膠(5.0wt%GelMA，紅色熒光標(biāo)記)為離散相，第二聚合物網(wǎng)絡(luò)(5.0wt%GelMA，綠色熒光標(biāo)記)為連續(xù)相。d)逐步說(shuō)明MB生物墨水的制造過(guò)程。鈣調(diào)素-AM/PI染色顯示C2C12S微凝膠活性高。

圖2.MB生物墨水的流變特性和組成的多樣性。a)純水凝膠生物墨水和MB生物墨水的示意圖。b)純水凝膠、MB墨水和JM墨水(均含有5.0wt%GelMA)的流變特性均隨剪切速率的增加而降低(0-50 s−1)。c)流變特性表明MB墨水和JM墨水的剪切模量與溫度無(wú)關(guān)，而GelMA水凝膠有臨界的凝膠-溶膠相變點(diǎn)。微凝膠含量分別為80%、85%和95%的MB生物油墨的流變特性顯示：d)剪切變稀特性，e)應(yīng)變屈服隨應(yīng)變?cè)黾?0-300%，1Hz)，以及f)通過(guò)低(無(wú)陰影，1%應(yīng)變，1 Hz)和高(陰影，300%應(yīng)變，1 Hz)應(yīng)變循環(huán)進(jìn)行自愈。

圖3.使用MB生物墨水的3D打印能力和保真度。a-i)MB生物墨水的細(xì)絲擠出和ii)共聚焦顯微鏡下的放大觀察，微凝膠(5.0wt%GelMA)標(biāo)記為紅色熒光，第二水凝膠(5.0wt%GelMA)標(biāo)記為綠色熒光。b)3D打印網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)i)使用MB生物墨水，具有放大視圖ii)在交叉口。c)3D打印雙環(huán)i)在可見(jiàn)光(405Nm)曝光時(shí)交聯(lián)，與GelMA微凝膠ii)在共聚焦顯微鏡下的圖像。d)3D打印管狀結(jié)構(gòu)(左視圖、俯視圖；右視圖、側(cè)視圖)。

圖4.MB生物墨水印刷構(gòu)件的機(jī)械特性。a)典型的應(yīng)力-應(yīng)變曲線和b)分別使用5wt%GelMA水凝膠、MB墨水和JM墨水的印刷圓柱體的壓縮彈性模量。c)使用JM油墨在60%應(yīng)變下進(jìn)行20次壓縮循環(huán)的印刷圓柱體的循環(huán)耐久性試驗(yàn)。d)使用60%應(yīng)變的MB墨水在1000次壓縮循環(huán)中對(duì)印刷圓筒進(jìn)行循環(huán)耐久試驗(yàn)。

圖5.3D打印可調(diào)節(jié)異質(zhì)微環(huán)境的血管化肝組織結(jié)構(gòu)。a)每種類型細(xì)胞的示意圖，即HepG2(紅色)和HUVECs(綠色)，水凝膠生物墨水和含7.5wt%GelMA的MB生物墨水的細(xì)胞空間排列。b)在i)第1天和ii)第3天使用水凝膠生物墨水在印刷纖維內(nèi)的HepG2(紅色)和HUVECs(綠色)細(xì)胞，用白色虛線表示印刷纖維的邊界。c)第一天和第三天使用MB生物墨水的印刷纖維內(nèi)的HepG2(紅色)和HUVECs(綠色)細(xì)胞。

圖6.肝功能和肝臟特異性基因和蛋白表達(dá)水平的評(píng)估。a)CCK-8比色法測(cè)定細(xì)胞增殖。b)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析白蛋白分泌。c)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析尿素產(chǎn)量。d)CYP3A4和CYP1A1酶活性分析。e)在第10天比較純GelMA水凝膠和MB生物墨水印制的肝構(gòu)建物的ALB、TTR和AFP表達(dá)水平。

總之，本文引入了細(xì)胞負(fù)載微凝膠雙雙相(MB)生物墨水的概念，作為3D擠壓生物打印的通用策略。MB生物墨水由細(xì)胞包裹的微凝膠組成，這些微凝膠被堵塞并通過(guò)第二個(gè)交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)連接。這種方法利用MB生物墨水的流變特性(即剪切變稀、屈服應(yīng)力和自恢復(fù))提供了延長(zhǎng)的生物制造窗口，從而具有優(yōu)異的生物印刷能力。本文打印了包括鼻子、耳朵、支氣管和腦模型在內(nèi)的3D復(fù)雜結(jié)構(gòu)，形狀逼真。此外，MB生物油墨在機(jī)械性能上具有很好的可調(diào)性，并且不犧牲其印刷性能，而且表現(xiàn)出超彈性行為、卓越的循環(huán)壓縮和拉伸耐久性。總體而言，MB生物墨水具有機(jī)械可調(diào)諧、超彈性和異質(zhì)微環(huán)境的設(shè)計(jì)靈活性，為組織工程和軟機(jī)器人等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的3D生物打印打開(kāi)了新的可能性。