Biomedicines|新型雙網(wǎng)絡水凝膠基于親和控釋原理實現(xiàn)抗人乳頭瘤病毒蛋白的長期釋放

水凝膠因其良好的生物相容性和與細胞外基質(zhì)成分的結構相似性在藥物遞送領域成為備受青睞的遞送載體。然而，傳統(tǒng)的單網(wǎng)絡（SN）水凝膠具有機械性能差以及藥物易突釋的局限。近日，清華大學生物制造團隊孫偉教授團隊博士研究生趙晨佳為第一作者， 連同英國諾丁漢大學 Jing Yang教授團隊共同在Biomedicines期刊發(fā)表題為“Affinity-Controlled Double-Network Hydrogel Facilitates Long-Term Release of Anti-Human Papillomavirus Protein”的文章，報道了一種新型雙網(wǎng)絡 (DN) 水凝膠，該材料體系不僅具有可調(diào)節(jié)的機械強度以及長期可控遞送抗病毒蛋白的特性，還可以根據(jù)需要進行個性化3D打印，在組織工程領域具有巨大的應用潛力。

背景介紹

近年來，生物工程蛋白質(zhì)藥物市場是制藥和生物技術市場中增長最快的領域之一。然而，治療性蛋白質(zhì)的基本劑型是凍干劑，由于吸收效率低、生物半衰期短的特點，其臨床療效受到了很大的限制。傳統(tǒng)的蛋白制劑通常需要通過頻繁注射的方式以達到理想的治療效果，但是這一方式增加了與劑量過量相關的不良副作用的風險，同時還降低了患者依從性。因此，開發(fā)能夠長期控釋蛋白藥物的原位遞送系統(tǒng)在減少不良反應和改善患者生活質(zhì)量方面具有重要意義。

清華大學孫偉教授團隊和英國諾丁漢大學 Jing Yang教授團隊共同開發(fā)了一種新型雙網(wǎng)絡（DN） 水凝膠系統(tǒng)，利用親和控釋原理以及雙網(wǎng)絡材料中致密的網(wǎng)絡結構，可實現(xiàn)抗病毒蛋白的長期平穩(wěn)釋放。該系統(tǒng)采用海藻酸（ALG）/聚乙二醇二丙烯酰酯（PEGDA）網(wǎng)絡來改善水凝膠的機械性能以及網(wǎng)絡密度，加入帶正電荷的單體 2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨 (AETAC)與模型蛋白電負性的抗人乳頭瘤病毒（HPV）蛋白（3-羥基鄰苯二甲酸酐修飾的牛β-乳球蛋白）產(chǎn)生靜電相互作用以實現(xiàn)延緩釋放的效果。與 PEGDA SN 水凝膠與ALG SN 水凝膠相比，ALG/PEGDA-AETAC DN 水凝膠具有穩(wěn)定高、機械強度好、柔性佳的特點。同時，DN 水凝膠顯著緩解了抗病毒蛋白的突釋，將釋放時間延長至14 天以上。結合研究者前期研究設計的仿生宮頸重構模型，采用數(shù)字光處理（DLP）技術打印DN水凝膠，可構建個性化載藥宮頸仿生植入物，為宮頸癌患者錐切術后的組織原位修復以及抗病毒治療提供了可能。該研究所開發(fā)的ALG/PEGDA-AETAC DN 水凝膠可以作為長期釋放負電蛋白質(zhì)的載體，良好的機械性能以及生物相容性顯示了未來應用于軟組織原位遞送的潛力。

實驗過程及結果

1.    雙網(wǎng)絡凝膠的制備

研究者采用兩步交聯(lián)法制備雙網(wǎng)絡水凝膠，首先海藻酸鈉與氯化鈣發(fā)生離子交聯(lián)形成脆性網(wǎng)絡。經(jīng)過紫外光照射后，PEGDA與AETAC單體在光引發(fā)劑的作用下發(fā)生化學交聯(lián)形成柔性網(wǎng)絡。

圖1. 雙網(wǎng)絡水凝膠的制備原理與過程

2. 雙網(wǎng)絡水凝膠的性能表征

水凝膠的力學測試結果顯示，ALG/PEGDA-AETAC DN 水凝膠的抗壓強度高于 PEGDA-AETAC SN 水凝膠。當 Igracure 2959 的濃度不低于 0.2% w/v時，ALG/PEGDA-AETAC DN 水凝膠的壓縮模量是 PEGDA-AETAC SN 的兩倍以上。此外可變的Igracure 2959 濃度提供了水凝膠的可調(diào)節(jié)的壓縮性能。除此之外，相比于SN水凝膠，DN水凝膠具有更低的溶脹系數(shù)以及更致密的孔隙結構，這種結構的形成進一步延緩了藥物的釋放，并在調(diào)節(jié)藥物釋放中起關鍵作用。

圖2. 雙網(wǎng)絡水凝膠的力學性能、溶脹系數(shù)以及微觀形貌表征

3 雙網(wǎng)絡水凝膠的細胞毒性測試

生物相容性是確定水凝膠是否可以進一步使用的先決條件。在這項研究中，研究者評估了 SN 和 DN 水凝膠浸提液中 NIH 3T3 細胞和 HUVECs 的生長，以驗證它們的細胞毒性。如圖3所示，CCK8檢測和細胞活/死染色均證明ALG/PEGDA-AETAC和 PEGDA-AETAC水凝膠幾乎沒有細胞毒性。根據(jù)ISO 10993-5:2009細胞毒性分類標準，細胞毒性等級為一級，為無毒，為將來的臨床應用提供了可能性。

圖3. SN與DN水凝膠的細胞毒性表征

4 雙網(wǎng)絡水凝膠的蛋白釋放特性

隨后，研究者比較了不同成分的水凝膠的蛋白釋放動力學曲線，發(fā)現(xiàn)DN水凝膠對抗HPV蛋白的控釋作用比SN水凝膠強。此外，帶正電基團 AETAC 的加入增強了水凝膠的控釋作用，這主要是由于AETAC的正電基團可與帶負電荷的抗 HPV 蛋白發(fā)生靜電相互作用。因此，ALG/PEGDA-AETAC對抗HPV蛋白的控釋效果最好，可以實現(xiàn)抗HPV蛋白長達14天的平穩(wěn)釋放。

圖4. 抗病毒蛋白于不同水凝膠中的釋放動力學曲線

5 雙網(wǎng)絡水凝膠的可打印性表征

研究還探索了DN水凝膠的可打印性以及潛在應用，在經(jīng)過DLP 3D打印后即可形成預定結構。為了驗證可行性，研究者打印了字母結構以及具有中空結構的錐體，可以觀察到ALG / PEGDA-AETAC DN水凝膠可以根據(jù)預設模型形成復雜的結構，上述錐體結構可用作宮頸癌錐切手術后的組織補片。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)所打印的結構可以在壓縮50%以上后恢復初始形態(tài)，這表明DN水凝膠具有良好的柔性以及在軟組織工程領域巨大的應用潛力。

圖5. DN水凝膠的可打印性測試

6 結論

本文報道了一種新型DN 水凝膠，其主要成分是 PEGDA、海藻酸鈉和帶正電荷的單體 AETAC。通過調(diào)節(jié)光引發(fā)劑的濃度，可以制備出與人體軟組織模量相匹配的DN水凝膠。此外，細胞毒性測試顯示所制備的DN 水凝膠支持細胞生長�；�于 ECM 中受控釋放啟發(fā)的親和控制遞送機制，DN水凝膠中的正電基團AETAC可以通過靜電相互作用來抑制負電蛋白的突釋并實現(xiàn)延長釋放時長的效果（超過 14 天）。與 SN 水凝膠相比，DN水凝膠中更致密的網(wǎng)絡結構也有助于蛋白的持續(xù)釋放。此外，該材料可以通過DLP 3D打印技術構建出具有高彈性的復雜結構，在組織工程中具有巨大的應用潛力。

Zhao C, Ji J, Yin T, et al. Affinity-ControlledDouble-Network Hydrogel Facilitates Long-Term Release of Anti-HumanPapillomavirus Protein[J]. Biomedicines, 2021, 9(10): 1298. https://doi.org/10.3390/biomedicines9101298

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