Nature 子刊：高密度細(xì)胞球懸浮打印構(gòu)建異質(zhì)組織

來源：EngineeringForLife

我們需要細(xì)胞模型在體外研究人類發(fā)育和疾病，以及篩選藥物的毒性和功效。目前的研究方法在功能化組織模型的構(gòu)建方面受到限制，這樣的模型需滿足必要的細(xì)胞密度和異質(zhì)性，以適當(dāng)?shù)啬�擬細(xì)胞和組織行為。在此，研究者開發(fā)了一種生物打印方法，以高分辨率將球體轉(zhuǎn)移到自愈合支撐水凝膠中，從而使其圖案化并按預(yù)先設(shè)定的空間位置融合到高細(xì)胞密度的微組織中。研究者生物打印了誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞來源的心臟微組織模型，該微組織有著空間上可控、且成比例的心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，以模擬心肌梗死后引發(fā)的疤痕性心臟組織的結(jié)構(gòu)和功能特性，包括收縮力減弱和不規(guī)律的電活動(dòng)。生物打印體外模型與功能讀數(shù)相結(jié)合，以探究各種促再生microRNA治療方案如何影響由心肌細(xì)胞增殖帶來的組織再生和功能恢復(fù)。該方法適用于一系列生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括開發(fā)精確模型來模擬疾病和篩選藥物，尤其是在高細(xì)胞密度和異質(zhì)性很重要的情況下。

相關(guān)研究以題為“3D bioprinting of high cell-density heterogeneous tissue models through spheroid fusion within self-healing hydrogels”發(fā)表于“Nature Communications”雜志，賓夕法尼亞大學(xué)的Jason A.Burdick教授為通訊作者，Andrew C. Daly為第一作者。

為了能實(shí)現(xiàn)球體的圖案化，研究者開發(fā)了一種在自愈合水凝膠中生物打印球體的方法：1. 真空抽吸介質(zhì)儲(chǔ)器中的球狀體；2. 將球體直接轉(zhuǎn)移至有剪切變稀特性的支撐水凝膠中；3. 由真空去除和水凝膠自愈合，將球體沉積到任意位置，如圖1a所示。這一過程是通過在兩個(gè)容器之間的用于球體輸送的狹窄通道將包含球體的培養(yǎng)基容器與包含支撐水凝膠的第二容器分離，如Movie 1所示。該方法避免了在液體和空氣界面之間轉(zhuǎn)移細(xì)胞和球體時(shí)，表面張力效應(yīng)會(huì)顯著降低細(xì)胞活力。支撐浴水凝膠由用金剛烷或β-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸組成，具有剪切變稀和自愈合的特性，在高應(yīng)變到低應(yīng)變的循環(huán)過程中，隨著剪切速率的增加，水凝膠粘度降低，存儲(chǔ)模量恢復(fù)，如圖1b所示。

圖1 自愈合支撐水凝膠中的生物3D打印球體

如圖2所示，研究者探討了水凝膠的流變性能對(duì)生物打印精度的影響。將聚合物濃度從3 wt%增加到7 wt%會(huì)產(chǎn)生具有更高存儲(chǔ)模量的水凝膠，這需要更高的應(yīng)變來引發(fā)屈服。研究者進(jìn)而評(píng)估了兩種球體尺寸的生物打印的精度（直徑分別為200和400μm）。對(duì)于XY軸精度，測(cè)量了所有聚合物濃度下球體直徑的~8–15％的漂移距離。對(duì)于Z軸精度，測(cè)量了所有聚合物濃度下相似的球體直徑~10–15％的漂移距離。這些漂移可通過在橢球體平移期間(在橢球體左側(cè))的水凝膠位移的熒光映射來可視化。通常這些距離很小，表明生物打印球體的精度很高，并支持將球體的高分辨率圖案化。打印后24小時(shí)內(nèi)球體中細(xì)胞的活力也得到了評(píng)估。在較低的聚合物濃度(3和5 wt%)時(shí)，細(xì)胞活力高(~90-95%)，而在最高聚合物濃度(7 wt%)時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降(~87%)。較低的聚合物濃度可能會(huì)減少球體平移過程中剪切力的影響，從而提高細(xì)胞的存活率。由于在所有聚合物濃度下生物打印精度都高，且在低聚合物濃度下細(xì)胞存活率最高，我們?cè)?br /> 所有后續(xù)研究中都使用了3 wt%的水凝膠。

圖2 支撐水凝膠流變性和生物3D打印精度

如圖3所示，研究者接下來探討了定向球體融合是否可用于制造結(jié)構(gòu)受控的多球體微組織。當(dāng)球體通過直接接觸進(jìn)行生物印記時(shí)，在培養(yǎng)的四天中觀察到融合。此外，當(dāng)以50μm的分離距離對(duì)球體進(jìn)行生物打印時(shí)，觀察到可比較的融合水平。這些距離在作者方法測(cè)得的精度范圍內(nèi)，從而最大程度地減少了球體可以以足夠接近球體融合的方式進(jìn)行生物打印的擔(dān)憂。利用這些特性，接下來將8個(gè)球狀體沉積成環(huán)形，從而在培養(yǎng)4天后使其連續(xù)融合成微組織環(huán)�？梢杂枚鄬忧蝮w重復(fù)此過程，以形成微組織管。重要的是，由于支撐水凝膠中交聯(lián)的非共價(jià)和可逆性質(zhì)以及柔軟的水凝膠機(jī)械性能，因此可以吸去支撐水凝膠以從融合的微組織中去除。

圖3 通過定向球體融合生物3D打印微組織

如圖4所示，研究者使用球體生物打印方法設(shè)計(jì)了局灶性心臟纖維化的簡(jiǎn)化模型。為了模擬健康和纖維化的心臟組織，將iPSC衍生的心肌細(xì)胞（iPSC-CMs）和人心臟成纖維細(xì)胞（CFs）的配成不同比率（“健康”模型 iPSC-CM：CFs=4：1；“疤痕”模型 iPSC-CM：CFs=1：4），這通過對(duì)心臟肌鈣蛋白T（cTnT）（CM marker）和波形蛋白（CF marker）的免疫熒光染色進(jìn)行了驗(yàn)證。接下來作者進(jìn)行了收縮記錄并使用開源的肌肉運(yùn)動(dòng)軟件來確定收縮幅度（與收縮力相關(guān)）和峰到峰值時(shí)間（心跳率或節(jié)奏）。與3天的疤痕對(duì)照組相比，健康的球體的收縮幅度顯著增加，并且趨向于更快的峰間時(shí)間~850ms（~70 bpm）。光學(xué)映射細(xì)胞內(nèi)Ca 2+顯示健康球體中的Ca 2+通量穩(wěn)定且同步，而在疤痕球體中僅觀察到較低水平的Ca 2+通量，且分散而零星分布。量化了心臟細(xì)胞周期的關(guān)鍵參數(shù)，包括鈣瞬變持續(xù)時(shí)間（CTD）（ms），峰到峰值時(shí)間（ms）和鈣通量幅度（F/Fo）。健康球體的CTD和鈣通量振幅顯著較高，健康球體的峰值時(shí)間顯著降低（即更快的去極化）�？傊�，這些結(jié)果表明，心臟球體中CM：CF
比率的變化證明了構(gòu)建健康和疤痕心臟組織模型的可行性。

圖4 制造心臟球體用于疾病模型應(yīng)用

通過健康和疤痕球體的定向融合來創(chuàng)建心臟組織的異質(zhì)環(huán)，可模擬局灶性心臟纖維化。環(huán)形結(jié)構(gòu)用于模擬心腔的組織水平電生理特性，包括再次出現(xiàn)心律不齊的可能性。為了對(duì)健康的心肌建模，對(duì)直接接觸的8個(gè)健康球體的環(huán)進(jìn)行了生物打印，而對(duì)有疤痕的心肌模型進(jìn)行了7個(gè)健康球體和1個(gè)瘢痕性球體的環(huán)的生物打印，如圖5所示。培養(yǎng)5天后，對(duì)cTnT和波形蛋白雙重染色證實(shí)了相鄰球體之間的融合，并且在疤痕微組織中觀察到了高成纖維細(xì)胞密度的區(qū)域�；钏廊旧�顯示融合5天后具有高細(xì)胞活力，并且iPSC-CM與CF的比例在培養(yǎng)期間保持不變。在微組織的健康區(qū)域也觀察到了健壯的肌節(jié)染色，在疤痕區(qū)域觀察到了較低的水平。另外，連接蛋白-43在細(xì)胞邊界處的染色表明在微組織的健康區(qū)域中間隙連接的形成，而在疤痕區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的染色水平較低。微組織環(huán)也以連續(xù)和同步的方式收縮，從支持水凝膠中取出后可以觀察到。微組織收縮的定量揭示了與健康對(duì)照組相比，疤痕微組織收縮幅度減小的趨勢(shì)，模仿了心肌梗死后整體收縮力的降低。

圖5 生物3D打印心臟微組織用于疾病模型應(yīng)用

如圖6所示，作者用疤痕心臟球體篩選了一系列miRNA治療持續(xù)時(shí)間（0、0–2、0–4和0–7天）。為了評(píng)估m(xù)iRNA處理的瞬時(shí)效果，在第2、4和7天進(jìn)行了順序收縮成像。與未治療的對(duì)照組相比，在相同的時(shí)間點(diǎn)，連續(xù)治療4天和7天觀察到的收縮幅度明顯增加。值得注意的是，在這些情況下，收縮值增加了大約三倍，并達(dá)到了健康球體中收縮幅度的~20％。當(dāng)培養(yǎng)基中仍存在miRNA時(shí)，收縮速度也比對(duì)照組顯著提高（快2倍）（4天0-4天治療，7天0-7天治療）。為了確定miRNA處理是否能促進(jìn)瘢痕狀球體中CM和CF的增殖，研究者在7天時(shí)進(jìn)行了EdU標(biāo)記（一種增殖標(biāo)記）以及cTnT和波形蛋白染色的共染色。存在cTnT+EdU+島，表明增殖和克隆擴(kuò)增，尤其是治療時(shí)間較長(zhǎng)（0-4天，0-7天）的情況。沒有觀察到Edu+細(xì)胞的數(shù)量增加，表明miRNA處理主要影響CM增殖。在健康的球體中也觀察到類似的趨勢(shì)，隨著cTnT數(shù)量的增加與對(duì)照組相比，在所有治療條件下均觀察到Edu+細(xì)胞，對(duì)CF增殖的影響有限。

圖6 評(píng)估m(xù)iRNA對(duì)心臟微組織行為的影響

論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41467-021-21029-2