301醫(yī)院郭全義團(tuán)隊(duì)Bioactive Materials｜生物3D打印仿生半月板

來源：上普生物

近期，301醫(yī)院郭全義主任團(tuán)隊(duì)在Bioactive Materials期刊上發(fā)表了“3D bioprinting of a biomimetic meniscal scaffold for application in tissue engineering”的文章。301醫(yī)院周建及田壯為本研究的第一作者，郭全義主任，唐佩福主任，世紀(jì)壇醫(yī)院姚琦主任為本研究的共同通訊作者。

摘要：通過生物3D打印創(chuàng)建合適的仿生支架是治療受損半月板的有前途的方法。然而，鑒于半月板獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的應(yīng)力環(huán)境，許多研究已經(jīng)采用了各種技術(shù)來充分利用不同材料的優(yōu)勢(shì)，例如結(jié)合注射或靜電紡絲的打印來追逐仿生半月板，這使得該過程成為可能。在某種程度上復(fù)雜。一些研究人員僅通過生物3D打印解決了挑戰(zhàn)，而其替代材料和模型卻受到了限制。在這項(xiàng)研究中，基于多層仿生策略，研究者優(yōu)化了半月板來源的生物墨水，甲基丙烯酸明膠（GelMA）/半月板細(xì)胞外基質(zhì)（MECM）的制備，以兼顧可打印性和細(xì)胞相容性。隨后，采用了具有雙噴嘴+多溫度打印功能的定制生物3D打印系統(tǒng)（上普BioMaker），以整合聚己內(nèi)酯（PCL）和載有半月形纖維軟骨軟骨細(xì)胞（MFCs）的GelMA / MECM生物墨水的優(yōu)勢(shì)，從而完成了具有最佳仿生性的仿生半月板支架形態(tài)和成分方面的特征。此外，進(jìn)行細(xì)胞存活力，力學(xué)，生物降解和體內(nèi)組織形成以確保支架具有足夠的可行性和功能性，從而為其在組織工程中的應(yīng)用提供可靠的基礎(chǔ)。

圖1 半月板打印的工藝流程

生物墨水的選擇
精心設(shè)計(jì)的仿生構(gòu)造可為半月板組織的再生提供合適的微環(huán)境。因此，在這項(xiàng)研究中，研究者試圖開發(fā)具有可印刷性和令人滿意的細(xì)胞相容性的半月板來源的生物墨水。當(dāng)前用于生物3D打印的生物墨水主要由天然聚合物組成，包括藻酸鈉，明膠，膠原蛋白，殼聚糖，纖維蛋白，透明質(zhì)酸和ECM 。其中，ECM保留了大多數(shù)天然成分，缺乏細(xì)胞免疫原性，是一種理想的生物材料，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。但是，由于ECM的成分復(fù)雜，它不溶于水和有機(jī)溶劑。因此，ECM很難被打印成3D結(jié)構(gòu)。為了實(shí)現(xiàn)ECM的可打印性，由于僅MECM顯示出差的膠凝性能和令人滿意的形狀保真度。實(shí)驗(yàn)中引入了明膠衍生物GelMA（上普G1）。可逆溫度敏感膠凝與簡(jiǎn)單，快速的光交聯(lián)結(jié)合在一起，已得到了廣泛的應(yīng)用。此外，它的強(qiáng)大的生物相容性使其成為極好的選擇。因此，在這項(xiàng)研究中，通過將MECM與特定濃度的GelMA混合，制成了既具有可打印性又具有細(xì)胞相容性的半月板來源的生物墨水。

圖2 半月板脫細(xì)胞基質(zhì)材料表征

打印工藝的調(diào)節(jié)
分析生物墨水的特性對(duì)于優(yōu)化打印參數(shù)至關(guān)重要。一些研究人員研究了GelMA的流變性能，并揭示了一定的穩(wěn)定性和剪切稀化特性。本文研究者的研究結(jié)果充分表征了GelMA / MECM的流變學(xué)特性，表明該生物油墨具有類似的特性。此外，這項(xiàng)研究表明，GelMA / MECM生物墨水對(duì)溫度敏感，并具有明顯的延遲，需要超過30分鐘才能達(dá)到穩(wěn)定性。由于在打印過程中零件之間的相互熱干擾，GelMA / MECM的粘彈性可能存在一些波動(dòng)，這些波動(dòng)可能會(huì)影響打印的平滑度和細(xì)胞的活力。因此，在這項(xiàng)研究中，選擇了電機(jī)驅(qū)動(dòng)打印而不是氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)打印。因此，即使GelMA / MECM由于溫度波動(dòng)而表現(xiàn)出一定的粘彈性變化，也不會(huì)明顯影響打印過程的平滑性。

多噴頭打印技術(shù)極大地?cái)U(kuò)展了可以選擇的材料范圍，這有利于構(gòu)建復(fù)雜的3D模型。但是，不同噴嘴和不同材料的配合仍然涉及許多細(xì)節(jié)。因此，有必要探索每種材料的印刷條件。在載有細(xì)胞的水凝膠的印刷方面，基于生物墨水和細(xì)胞的類型存在一些差異。在這項(xiàng)研究中，為確保高保真度和高細(xì)胞活力（大于90％），需要反復(fù)調(diào)整包括GelMA / MECM濃度比，噴嘴的內(nèi)徑，打印溫度和打印速度在內(nèi)的各種參數(shù)。PCL的打印相對(duì)簡(jiǎn)單，唯一要點(diǎn)是調(diào)整打印溫度和速度。這項(xiàng)研究中的挑戰(zhàn)是如何很好地協(xié)調(diào)兩個(gè)噴嘴和材料，以同時(shí)保證結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，細(xì)胞活力和所需的機(jī)械性能。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，最終確定以85°C為最佳PCL打印溫度，并根據(jù)凝膠動(dòng)力學(xué)確定了20°C的水凝膠打印溫度。打印平臺(tái)溫度為20°C也是絕對(duì)突出的條件，有助于防止GelMA / MECM凝膠由于交聯(lián)前相對(duì)較高的室溫而轉(zhuǎn)變成溶液。否則，可能會(huì)破壞孔的形成。實(shí)際上，要解決整個(gè)過程中的關(guān)鍵問題，需要對(duì)材料和打印原理有充分的了解，并且這樣的了解將允許在不同領(lǐng)域中順利創(chuàng)建許多定制模型。

圖4 生物墨水的流變學(xué)分析

圖5 半月板仿生支架

細(xì)胞活性
細(xì)胞活力和機(jī)械性能是用于驗(yàn)證該研究模型成功的初步標(biāo)準(zhǔn)。許多因素，包括生物墨水成分以及打印模型和參數(shù)，都會(huì)影響打印過程中的細(xì)胞活力。在這項(xiàng)研究中，使用單噴嘴和雙噴嘴印刷進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)試，然后在體外培養(yǎng)1天和14天。細(xì)胞活力超過90％。此外，將水凝膠培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)6周，細(xì)胞活力保持在90％以上。這些數(shù)據(jù)證明了該打印模型的可行性以及該研究中所用材料的良好細(xì)胞相容性。

圖3 生物墨水的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

圖6 打印后的細(xì)胞活性

力學(xué)性能
總體而言，這項(xiàng)研究解決了穩(wěn)定性和均勻性的問題，就機(jī)械性能而言，研究者試圖增加PCL單絲間距并減小PCL單絲直徑以實(shí)現(xiàn)更好的機(jī)械仿生。最終，PCL單絲直徑設(shè)置為500μm，間距設(shè)置為1000μm。構(gòu)造物的壓縮模量為12.63 MPa，高于人類半月板的壓縮模量（0.3–2 MPa）。此外，受積分模型的限制，拉伸模量為24.86 MPa，在徑向方向上接近半月板的拉伸模量（4-20 MPa）。但是，與周向拉伸模量（78-120 MPa）相比，仍然存在很大差異。

圖7 打印支架的力學(xué)性能

體內(nèi)降解分析
隨著熒光成像技術(shù)的發(fā)展，可以以無創(chuàng)方式在體內(nèi)連續(xù)監(jiān)測(cè)水凝膠，從而為評(píng)估水凝膠的生物降解提供了一種有效而可靠的方法。這項(xiàng)研究考慮了這些因素，并結(jié)合了可用技術(shù)設(shè)計(jì)了定制的生物降解研究方案。首先，研究者將印有細(xì)胞的水凝膠支架培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)八周，以驗(yàn)證其基本穩(wěn)定性。然后，在原位植入支架以評(píng)估PCL的生物降解，并在小鼠皮下植入Cy7標(biāo)記的支架以通過體內(nèi)成像監(jiān)測(cè)水凝膠的降解。結(jié)果表明，支架中水凝膠的生物降解需要大約一個(gè)月的時(shí)間。分子量和納米壓痕測(cè)試的結(jié)果用于評(píng)估PCL骨架的原位降解。有關(guān)PCL結(jié)構(gòu)生物降解的結(jié)果與其他研究相似。支架的分子量在3個(gè)月時(shí)沒有顯著差異，但在6個(gè)月時(shí)有所降低。但是，一些支架在3個(gè)月時(shí)開始出現(xiàn)損傷，而在6個(gè)月時(shí)僅可見這些支架的剩余部分。最初的微環(huán)境可能對(duì)支架的完整性影響很小，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和分子量的降低，支架的強(qiáng)度逐漸減弱，從而導(dǎo)致上述結(jié)果。該結(jié)果表明，半月板的機(jī)械環(huán)境可能起決定性作用。

圖8 皮下水凝膠降解的定量熒光分析

結(jié)論
借助定制的雙噴頭+多溫度控制打印系統(tǒng)和半月板衍生的生物墨水，本研究充分結(jié)合了PCL和GelMA / MECM / MFCs的優(yōu)勢(shì)，從而在形態(tài)上初步實(shí)現(xiàn)了與天然半月板類似的仿生支架包括形態(tài)，機(jī)械性能，成分組成和微環(huán)境。這種方法明顯提高了仿生半月板支架在組織工程中的水平和效率。此外，進(jìn)行了各種實(shí)驗(yàn)以確保支架在各種應(yīng)用中的可行性和功能性。然而，該支架在某些方面仍與天然半月板不同。 PCL具有很大的硬度和不足的柔韌性。 MECM在脫細(xì)胞后失去其原始的物理性能，并且僅通過材料的逐層堆疊才能實(shí)現(xiàn)部分仿生，這與高度交聯(lián)的半月板膠原纖維的環(huán)狀排列不同。因此，材料科學(xué)和打印技術(shù)的改進(jìn)可能是推動(dòng)組織工程學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵。當(dāng)前，不同技術(shù)的結(jié)合對(duì)于實(shí)現(xiàn)半月板的更高水平的仿生品可能是有效的。

參考文獻(xiàn)
Zhou Jian, Tian Zhuang, Tian Qinyu, Peng Liqing, Li Kun, Luo Xujiang, Wang Diaodiao, Yang Zhen, Jiang Shuangpeng, Sui Xiang, Huang Jingxiang, Liu Shuyun, Hao Libo, Tang Peifu, Yao Qi, Guo Quanyi,

3D bioprinting of a biomimetic meniscal scaffold for application in tissue engineering,Bioactive Materials,Volume 6, Issue 6,2021,1711-1726

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2020.11.027.