頂刊GUT3D打印功能性肝臟實(shí)現(xiàn)肝衰修復(fù)

來(lái)源：上普生物

導(dǎo)讀：肝臟是人體最重要的器官之一，是人體代謝、排毒、膽汁分泌的重要器官，由于其復(fù)雜的功能性，肝臟的治療尤為困難和重要。北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科毛一雷主任團(tuán)隊(duì)使用上普生物3D打印設(shè)備，打印出具有功能性的肝臟類器官，移植到肝衰小鼠體內(nèi)后成功形成功能性血管系統(tǒng)，并可以有效延長(zhǎng)肝衰小鼠的壽命，具有人肝臟的藥物代謝的功能。此研究于5月20日在線發(fā)表在消化病學(xué)和肝病學(xué)領(lǐng)域的頂級(jí)期刊GUT（IF=17.943）上，也是生物3D打印技術(shù)目前在實(shí)際應(yīng)用方面的最深入的文章。

目前掌握的信息和技術(shù)有哪些？
對(duì)于晚期的器官衰竭治療，器官供體短缺仍是嚴(yán)峻的難題
生物3D打印是構(gòu)建體外器官的解決方案之一
3D打印功能性組織器官及其在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用仍是難點(diǎn)

本研究有哪些突破？
本研究的3D打印肝臟類器官具有肝臟功能，如白蛋白分泌、藥物代謝、糖原儲(chǔ)存等
3D打印肝臟類器官移植到肝衰小鼠腹腔后可以延長(zhǎng)壽命，分泌肝臟特異性蛋白，并具有人肝臟的藥物代謝的功能。
移植后3D打印肝臟類器官形成功能性血管網(wǎng)絡(luò)，可以有效增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸能力

此研究對(duì)于臨床有什么影響？
此研究印證了生物3D打印技術(shù)在肝臟移植治療中的潛在價(jià)值，我們可以通過(guò)這種技術(shù)輔以相應(yīng)的細(xì)胞制造出人造器官，并將其移植到人體中并發(fā)揮正常的生理功能以治療特定疾病。
人體的超級(jí)工廠—肝臟

肝臟是機(jī)體最大的腺體，它在機(jī)體的代謝﹑膽汁生成﹑解毒﹑凝血﹑免疫﹑熱量產(chǎn)生及水與電解質(zhì)的調(diào)節(jié)中均起著非常重要的作用，是機(jī)體內(nèi)的一個(gè)巨大的“化工廠”。

肝臟承擔(dān)的主要功能如下：

• 代謝與消化：腸道的血液里有糖類、脂肪、維生素、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)肝臟的代謝處理后，才能被人體吸收。
• 免疫與排毒：血氧里的各種毒素、有害物質(zhì)、甚至不需要的物質(zhì)，通過(guò)肝臟24小時(shí)不停的工作分解破壞，最后通過(guò)腎臟和腸道排出。
• 維生素貯存與代謝：肝臟是維生素C、D、E、K、B1、B6、B12、煙酸、葉酸等多種維生素貯存和代謝的場(chǎng)所。
• 血液調(diào)節(jié)：正常時(shí)肝內(nèi)靜脈竇可以貯存一定量的血液，在機(jī)體失血時(shí)，從肝內(nèi)靜脈竇排出較多的血液，以補(bǔ)償周圍循環(huán)血量的不足。
• 然而，肝臟是唯一沒有痛感神經(jīng)的器官，所以對(duì)于肝臟的輕微癥狀沒有明顯的疼痛感覺。但一旦感到肝區(qū)疼痛，那就是肝臟發(fā)生腫大后牽動(dòng)了周圍的組織和肝的外膜所致，這樣往往后果很嚴(yán)重。
  

3D打印肝臟類器官
對(duì)于晚期的肝病患者，有限的肝移植數(shù)量、部分體外肝支持以及通過(guò)注射肝細(xì)胞進(jìn)行的小規(guī)模治療的效果和效率都十分有限。為了可以構(gòu)建出用于移植和再生醫(yī)學(xué)的體外功能性肝臟類器官，需要克服幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：

• 具有足夠細(xì)胞量的精密結(jié)構(gòu)組織
• 與體內(nèi)肝功能相匹配的三維微環(huán)境
• 移植手術(shù)過(guò)程中易于處理和固定
  

毛一雷教授團(tuán)隊(duì)為了解決上述問題和難點(diǎn)，采用生物3D打印方式構(gòu)建含有HepaRG細(xì)胞的三維肝臟類器官（Hepatorganoids），并在體外分化出具有白蛋白分泌、藥物代謝、糖原儲(chǔ)存等功能性的肝細(xì)胞。并將此類器官移植到肝衰的小鼠體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證其功能性。

3D打印功能性肝臟類器官的技術(shù)路線

工藝參數(shù)決定肝細(xì)胞存活
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，材料的配比會(huì)影響肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、存活率以及細(xì)胞增殖。綜合考慮和實(shí)驗(yàn)摸索后，團(tuán)隊(duì)選用5%明膠搭配1%的海藻酸鈉作為打印墨水（上普A1同源墨水）。

生物3D打印機(jī)同樣采用上普多噴頭細(xì)胞3D打印系統(tǒng)，此設(shè)備具有成型環(huán)境溫控技術(shù)，可以為打印體提供更均勻的溫度傳導(dǎo)。最終研究團(tuán)隊(duì)將噴頭溫度控制在20℃，成型環(huán)境控制在10℃進(jìn)行打印，并構(gòu)建出具有500微米的支架孔隙，以助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣的供應(yīng)和代謝廢物的排泄。

媲美原代人肝的肝臟類器官
將通過(guò)對(duì)分化7天后的3D打印的肝臟類器官進(jìn)行一系列肝功能檢測(cè)，研究者發(fā)現(xiàn)，其肝功能蛋白表達(dá)（ALB、CK18、AAT、MRP2、TRANSFERRIN等）不僅遠(yuǎn)高于2D肝細(xì)胞和基質(zhì)膠3D肝細(xì)胞，并且與原代人肝細(xì)胞的表達(dá)非常接近。研究者發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)?D打印的肝臟類器官更好地誘導(dǎo)了肝特異性轉(zhuǎn)錄因子（FOXA2、HNF4A等）。更重要的是，3D打印的肝臟類器官分泌的白蛋白、α-1抗胰蛋白酶和因子VII與原代人肝細(xì)胞的分泌相當(dāng)。

通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)3D打印的肝臟類器官的排毒功能依然遠(yuǎn)高于2D肝細(xì)胞和基質(zhì)膠3D肝細(xì)胞，并且與原代人肝細(xì)胞相當(dāng)。而在形態(tài)方面，3D打印的肝臟類器官構(gòu)成團(tuán)簇，并且細(xì)胞積累了糖原聚集體，說(shuō)明3D打印的肝臟類器官在分化后達(dá)到了肝功能的水平。

3D打印的肝臟類器官的肝功能表達(dá)對(duì)比

顯著延長(zhǎng)肝衰小鼠壽命
為研究3D打印肝臟類器官在體內(nèi)的肝臟功能，研究團(tuán)隊(duì)將其移植到肝衰的小鼠體內(nèi)。研究表明，移植后的小鼠壽命延長(zhǎng)了近一倍，并且由于移植的肝臟類器官具有足量的肝細(xì)胞，小鼠體重減輕現(xiàn)象也顯著下降。并且移植后小鼠肝功能指標(biāo)的血清水平也有顯著上升。此研究結(jié)果表明，3D打印肝臟類器官有效的治療小鼠的肝衰。

更加令人振奮的是，小鼠肝臟在移植14天后自發(fā)的構(gòu)建出血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，這也進(jìn)一步論證了3D打印肝臟類器官在移植后的體內(nèi)功能性以及其確保壽命延長(zhǎng)的心血管化的形成。

最終，為分析小鼠肝臟的藥物代謝能力，研究者使用異哇胍，這種藥物只有人肝細(xì)胞才能夠代謝，而小鼠肝臟不能代謝。通過(guò)檢測(cè)代謝產(chǎn)物，明確了肝臟類器官在小鼠體內(nèi)具有人肝臟的代謝功能。

小鼠肝臟在移植14天后自發(fā)的構(gòu)建出血管

總結(jié)
構(gòu)建用于臨床治療的完整肝臟器官仍然是一個(gè)需要攻克的遠(yuǎn)期目標(biāo)，但本研究成功邁出了重要一步：通過(guò)生物3D打印構(gòu)建出具有體內(nèi)肝功能的肝臟類器官，無(wú)論在體外還是體內(nèi)都具有顯著的肝功能性。小鼠肝臟在移植14天后自發(fā)的構(gòu)建出血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，并有效的延長(zhǎng)的肝衰小鼠的壽命。本文是生物3D打印技術(shù)目前在實(shí)際應(yīng)用方面的最深入的文章。相信隨著技術(shù)的不斷精進(jìn)，我們距離生物打印完整功能器官又更近一步。