預血管化骨類器官的 3D 生物打印用于快速原位顱骨修復研究進展

來源：EFL生物3D打印與生物制造

顱骨缺損，尤其是關(guān)鍵尺寸的顱骨缺損，因其自身再生能力有限，存在愈合時間長、再生不完全及骨不連風險高等問題。當前臨床修復手段如金屬植入物、同種異體移植物和人工移植物等，面臨供體有限、存在疾病傳播風險及修復效果不理想等挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)骨組織工程的“自上而下”方法（細胞接種于生物材料支架）存在細胞分布不均、營養(yǎng)擴散不足、支架降解困難等缺陷，且難以復制骨骼復雜結(jié)構(gòu)，同時干細胞聚集體體外成骨誘導時間長、血管化不足，限制了快速原位成骨。  

為解決上述問題，清華大學熊卓、方永聰課題組與北京協(xié)和醫(yī)學院楊斌課題組合作，提出一種新型發(fā)育工程策略，將間充質(zhì)干細胞（MSCs）、人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）與成骨微顆粒結(jié)合，大規(guī)模構(gòu)建具有自組織血管化和成骨特性的預血管化骨類器官。團隊系統(tǒng)篩選出石墨烯氧化物（GO）作為最優(yōu)成骨微顆粒，其通過粘著斑和PI3K/Akt通路顯著促進成骨分化。進一步將類器官負載于明膠甲基丙烯酰酯（GelMA）水凝膠中進行3D生物打印，構(gòu)建具有高細胞密度和成骨能力的復雜組織構(gòu)建體。體內(nèi)實驗證實，該方法可促進快速血管化骨組織形成，實現(xiàn)顱骨缺損的有效原位再生修復。  

相關(guān)工作以“3D Bioprinting of Prevascularized Bone Organoids for Rapid In Situ Cranial Bone Reconstruction”為題發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》上。北京協(xié)和醫(yī)學院2022級整形外科博士生段婧為第一作者，清華大學熊卓教授、方永聰助理教授及協(xié)和醫(yī)學院楊斌教授為共同通訊作者。

1. 研究設計與實驗流程示意圖。通過示意圖展示研究整體設計及實驗流程，研究對象為預血管化骨類器官的構(gòu)建及其在顱骨修復中的應用。結(jié)果表明，結(jié)合間充質(zhì)干細胞、內(nèi)皮細胞與成骨微顆粒（如石墨烯氧化物）的預血管化骨類器官，經(jīng)3D生物打印后可促進原位血管化骨再生，為顱骨缺損修復提供新策略。      

圖1. 預血管化骨類器官研究設計及實驗流程示意圖。   

2. 預血管化成骨聚集體的表征與優(yōu)化。采用強制聚集技術(shù)制備含不同成骨微顆粒（羥基磷灰石、生物玻璃、石墨烯氧化物等）的細胞聚集體，通過實時定量PCR、免疫熒光染色等方法評估成骨基因表達與細胞活性。結(jié)果表明，石墨烯氧化物（GO）組的成骨相關(guān)基因（如ALP、COL-1、Runx-2）表達顯著高于其他組，且細胞相容性良好，證實GO對成骨分化的促進作用最優(yōu)。      

圖2. 預血管化成骨聚集體的表征與優(yōu)化。   

3. 負載GO的預血管化骨類器官的成骨與血管化評估。利用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色及血管生成實驗，研究GO負載的預血管化骨類器官的成骨礦化能力與血管網(wǎng)絡形成。結(jié)果表明，GO促進鈣沉積與成骨分化，且含內(nèi)皮細胞的聚集體可自組織形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)，CD31表達證實血管化能力，說明該類器官兼具成骨與血管化特性。      

圖3. GO負載預血管化骨類器官的成骨與血管化特性。   

4. GO促進成骨分化的分子機制轉(zhuǎn)錄組分析。通過mRNA測序與生物信息學分析，研究GO影響成骨的分子通路。結(jié)果顯示，GO組差異表達基因富集于粘著斑、PI3K/Akt信號通路等，Western blot驗證PI3K、AKT等蛋白表達上調(diào)，證實GO通過激活粘著斑和PI3K/Akt通路促進成骨分化與細胞外基質(zhì)合成。      

圖4. 預血管化骨類器官的轉(zhuǎn)錄組分析與機制探究。   

5. 預血管化骨類器官的3D生物打印工藝與性能。選用7.5 wt.% GelMA水凝膠作為生物墨水載體，通過流變學測試優(yōu)化打印參數(shù)，結(jié)合活/死染色評估細胞 viability。結(jié)果表明，打印結(jié)構(gòu)具有良好的擠出穩(wěn)定性與細胞活性（ viability ≈85.63%），且內(nèi)皮細胞可形成血管網(wǎng)絡，證實3D打印技術(shù)可實現(xiàn)類器官的規(guī)�；瘶�(gòu)建與功能保留。      

圖5. 預血管化骨類器官負載生物墨水的3D生物打印。   

6. 顱骨缺損修復的體內(nèi)效果評估。在大鼠顱骨缺損模型中植入不同處理的生物打印 construct，通過顯微CT、組織學染色（H&E、Masson三色）及免疫熒光染色評估骨再生與血管化。結(jié)果表明，含GO與內(nèi)皮細胞的預血管化骨類器官組（M+H+GO）新骨覆蓋率、骨體積分數(shù)（BV/TV=32.28±4.48%）及血管密度顯著高于其他組，且促進M2型巨噬細胞極化，證實其高效的原位骨再生與抗炎能力。      

圖6. 預血管化骨類器官修復顱骨缺損的體內(nèi)評估。   

7. 血管化與免疫響應評估。利用磁共振成像（MRI）與免疫熒光染色，分析缺損區(qū)域的血管網(wǎng)絡形成與巨噬細胞極化。結(jié)果顯示，預血管化組（M+H、M+H+GO）血管體積顯著大于對照組，且GO負載組CD163+（M2型）巨噬細胞比例升高，表明預血管化骨類器官通過增強血管化與免疫調(diào)節(jié)促進骨再生。      

圖7. 顱骨缺損修復的血管化與免疫響應分析。

研究結(jié)論
本研究提出一種結(jié)合預血管化骨類器官與3D生物打印的新策略，用于快速原位顱骨再生。通過將間充質(zhì)干細胞、內(nèi)皮細胞與成骨微顆粒（如石墨烯氧化物）整合，構(gòu)建了具有自組織血管化能力和增強成骨特性的類器官。3D生物打印技術(shù)將類器官負載于水凝膠中，形成定制化的大型骨移植物，實現(xiàn)了接近生理細胞密度的血管化骨組織構(gòu)建。體內(nèi)實驗顯示，該方法通過激活粘著斑和PI3K/Akt通路促進成骨分化，并通過內(nèi)皮細胞自組裝形成血管網(wǎng)絡，顯著加速顱骨缺損的原位骨形成，同時誘導抗炎性M2巨噬細胞極化。研究結(jié)果表明，這種發(fā)育工程策略克服了傳統(tǒng)支架方法的局限性，為骨再生提供了可擴展的有效途徑，有望推動生物制造和組織工程在臨床再生治療中的應用。


文章來源：
https://advanced.onlinelibrary.w ... 1002/adhm.202501376