3D 生物打印人工皮膚！湖南師范大學(xué)劉中華、陳海燕：開(kāi)啟皮膚與毛囊再生的臨床新征程

來(lái)源：EFL生物3D打印與生物工程

皮膚作為人體重要器官，一旦完整性受損形成傷口，不僅會(huì)給患者帶來(lái)痛苦，增加感染風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)對(duì)生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，全球先進(jìn)傷口護(hù)理市場(chǎng)規(guī)模龐大，尋找高效治療手段迫在眉睫。當(dāng)前，大面積皮膚創(chuàng)傷的治療方式，如自體皮膚移植存在供體部位有限、易感染等問(wèn)題，而人工皮膚替代品也無(wú)法實(shí)現(xiàn)包括毛囊、汗腺、血管和皮脂腺等皮膚附屬器的完全功能性、無(wú)瘢痕再生。毛囊作為皮膚重要附屬器，在抵御外界刺激、促進(jìn)傷口愈合等方面意義重大，但利用真皮乳頭細(xì)胞進(jìn)行組織工程存在獲取困難、體外培養(yǎng)時(shí)再生潛能難以維持等局限。  

為解決這些難題，湖南師范大學(xué)劉中華、陳海燕團(tuán)隊(duì)利用3D生物打印技術(shù)，將表皮干細(xì)胞和皮膚源性前體細(xì)胞與明膠甲基丙烯酸酯和透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯組成的多組分水凝膠相結(jié)合，制備出預(yù)制人工皮膚。相關(guān)工作以《3D bioprinting of prefabricated artificial skin with multicomponent hydrogel for skin and hair follicle regeneration》為題發(fā)表在《Theranostics》上。湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳海燕副教授和劉中華教授為本文的共同通訊作者，陳海燕副教授研究團(tuán)隊(duì)成員馬瀟瀟和朱肖慧為本文的共同第一作者。該研究成果能有效促進(jìn)傷口愈合，實(shí)現(xiàn)表皮、真皮、毛囊、血管和皮脂腺等組織的再生，為皮膚修復(fù)和毛囊再生提供了新的解決方案，也為人工皮膚的體外培養(yǎng)和保存奠定了理論基礎(chǔ)。

研究?jī)?nèi)容
1. 多組分水凝膠的表征與3D打印性能評(píng)估
通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）、溶脹率測(cè)定、溶解度測(cè)定、流變學(xué)測(cè)定及3D打印實(shí)驗(yàn)等方法，研究不同濃度多組分水凝膠的微觀(guān)結(jié)構(gòu)、溶脹溶解性能、機(jī)械性能和打印性能。結(jié)果表明，多組分水凝膠呈現(xiàn)相互連通的三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔徑5 - 30μm，濃度增加時(shí)孔徑減小、溶脹率和溶解度降低、機(jī)械穩(wěn)定性增強(qiáng)；確定5% GelMA - 0.5% HAMA水凝膠打印性能良好，適合用于后續(xù)研究。

圖1. 多組分水凝膠的表征及打印性能評(píng)估。  

2. SKPs在多組分水凝膠中的活力、增殖及AP表達(dá)研究
采用細(xì)胞活力染色、細(xì)胞增殖檢測(cè)及堿性磷酸酶（AP）染色等方法，研究3D打印過(guò)程及不同多組分水凝膠對(duì)SKPs增殖和活性的影響。結(jié)果顯示，3D打印后第1天，SKPs在多組分水凝膠中活力超95%，第3天雖略有下降但仍超90%，且各水凝膠組中SKPs均有不同程度增殖；AP染色表明多組分水凝膠未影響SKPs毛囊再生潛能，5% GelMA - 0.5% HAMA水凝膠組中AP表達(dá)顯著升高。

圖2. SKPs在多組分水凝膠中的增殖和活力。  

3. 人工皮膚中Epi - SCs和SKPs的細(xì)胞學(xué)分析
運(yùn)用免疫熒光（IF）染色、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT - qPCR）和流式細(xì)胞術(shù)分析，研究3D打印和三維培養(yǎng)對(duì)SKPs細(xì)胞特性、干性及毛囊誘導(dǎo)潛能的影響，以及多組分水凝膠對(duì)Epi - SCs的影響。結(jié)果表明，SKPs在人工皮膚中穩(wěn)定表達(dá)相關(guān)標(biāo)記蛋白，干性基因和毛囊誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)顯著增加；Epi - SCs在多組分水凝膠中培養(yǎng)，其表面標(biāo)記CD49f和CD29表達(dá)與傳統(tǒng)培養(yǎng)組無(wú)顯著差異，說(shuō)明該人工皮膚具有皮膚附屬器再生潛力。

圖3. 人工皮膚中干細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)分析。  

4. 含SKPs和Epi - SCs的3D打印人工皮膚促進(jìn)體內(nèi)皮膚和毛囊再生
利用裸鼠皮膚和毛囊重建模型，通過(guò)移植3D打印的含Epi - SCs、SKPs和5% GelMA - 0.5% HAMA水凝膠的人工皮膚，觀(guān)察傷口愈合情況，進(jìn)行H&E染色、免疫熒光染色檢測(cè)。結(jié)果顯示，人工皮膚促進(jìn)傷口完全愈合，有明顯毛發(fā)生長(zhǎng)，成功再生毛囊、表皮、真皮、血管和皮脂腺，表明該人工皮膚能有效促進(jìn)體內(nèi)皮膚及附屬器再生。

圖4. 人工皮膚展現(xiàn)出皮膚及其附屬器再生的能力。  

5. 預(yù)制人工皮膚促進(jìn)體內(nèi)皮膚和毛囊再生
將人工皮膚在體外培養(yǎng)6和12 h后移植到裸鼠傷口，通過(guò)觀(guān)察毛發(fā)再生情況、H&E染色、免疫熒光染色和毛發(fā)數(shù)量統(tǒng)計(jì)，研究預(yù)制人工皮膚的再生能力。結(jié)果表明，體外培養(yǎng)6和12 h的人工皮膚仍能促進(jìn)傷口毛發(fā)再生，實(shí)現(xiàn)表皮、真皮、毛囊、血管和皮脂腺再生，雖培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)毛發(fā)密度有所降低，但12 h內(nèi)毛囊再生可行，為細(xì)胞負(fù)載人工皮膚的預(yù)制提供了理論依據(jù)。

圖5. 預(yù)制人工皮膚展現(xiàn)出表皮及其相關(guān)附屬器再生的能力。

研究結(jié)論
本研究整合組織工程與3D生物打印技術(shù)，成功開(kāi)發(fā)出全層皮膚再生的方法。研究選用打印性能優(yōu)良、溶解性和溶脹率低、機(jī)械性能穩(wěn)定的多組分光敏水凝膠，通過(guò)3D生物打印封裝表皮干細(xì)胞和皮膚源性前體細(xì)胞，制備出可定制的人工皮膚。這種人工皮膚不僅有助于無(wú)瘢痕愈合，更重要的是能夠再生毛囊、血管和皮脂腺等皮膚附屬器。該方法在皮膚組織工程及相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用的巨大潛力，為皮膚修復(fù)和皮膚附屬器再生提供了新的策略，也為后續(xù)細(xì)胞負(fù)載人工皮膚的體外培養(yǎng)研究奠定了基礎(chǔ)。

文章來(lái)源：https://www.thno.org/v15p2933.htm