3D生物打印仿生多層皮膚以改善傷口愈合

來(lái)源： 光譜與液芯器械醫(yī)工交叉團(tuán)隊(duì)

修復(fù)全層皮膚缺損是臨床實(shí)踐中的一大挑戰(zhàn)。活細(xì)胞和生物材料的生物打印是解決該挑戰(zhàn)的一種很有前途的技術(shù)。然而，有限的生物材料來(lái)源、耗時(shí)的材料準(zhǔn)備及其成型工藝是必須解決的瓶頸�；�于此，來(lái)自解放軍總醫(yī)院的Minliang Chen團(tuán)隊(duì)在《ACS Applied Materials & Interfaces》期刊發(fā)表了題為“3D-Bioprinted Biomimetic Multilayer Implants Comprising Microfragmented Adipose Extracellular Matrix and Cells Improve Wound Healing in a Murine Model of Full-Thickness Skin Defects”的文章。該研究開發(fā)了一種新穎、快速且簡(jiǎn)單的方法。該方法直接處理脂肪組織以獲得微碎片脂肪ECM(mFAECM)，但它無(wú)法打印。為了使mFAECM具有可打印性，將其與甲基丙烯酰化明膠(GelMA)和甲基丙烯�；�透明質(zhì)酸(HAMA)混合制成復(fù)合生物墨水。同時(shí)，本研究以mFAECM為生物墨水主要成分，制備出對(duì)應(yīng)真皮、表皮、血管化的不同生物墨水，完成仿生多層皮膚的生物打印。傷口愈合試驗(yàn)顯示出生物打印的皮膚具有良好的治療效果。

1、mFAECM的制備和表征

脂肪抽吸物經(jīng)過(guò)三次凍融循環(huán)后均質(zhì)化，得到均勻的乳化懸浮液。離心后，產(chǎn)品上層呈透明油狀，中層呈淡黃色ECM，底層呈大而粗的纖維。獲得 ECM后，用異丙醇反復(fù)萃取，直至無(wú)黃色油狀物殘留。均質(zhì)后的ECM具有均勻致密的絮狀外觀。DAPI染色顯示ECM碎片小于100 μm × 200 μm，因此可以輕松穿過(guò)內(nèi)徑為 300 μm的噴頭。對(duì)mFAECM和天然組織主要成分的分析表明，膠原蛋白含量分別為110.38±9.60μg/mg和99.2±10.54μg/mg，sGAG(糖胺聚糖)含量分別為2.85±0.35μg/mg和3.11±0.40μg/mg。這表明天然組織的大部分膠原蛋白和sGAG保留在mFAECM中。膠原蛋白和糖胺聚糖對(duì)組織再生很重要，并負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)傷口愈合過(guò)程中的組織穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞遷移和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。

圖 1. mFAECM的制備和特性

2、仿生多層皮膚的制造
為了評(píng)估m(xù)FAECM復(fù)合生物墨水的可打印性，該研究應(yīng)用3D打印制造了圓形、網(wǎng)狀四層結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)具有高保真度，并且與設(shè)計(jì)圖案高度一致。高清相機(jī)拍攝的圖像顯示，生物墨水軌跡保持連續(xù)，每條細(xì)絲獨(dú)立分布，不會(huì)合并或折疊。SEM圖像顯示細(xì)胞附著在孔隙上。總之，mFAECM復(fù)合生物墨水具有良好的可打印性和保真度，可以支持細(xì)胞附著。

圖 2. 仿生多層皮膚的制造和微觀結(jié)構(gòu)

3、仿生多層皮膚促進(jìn)小鼠的皮膚傷口愈合

目前還沒關(guān)于直接將脂肪來(lái)源的、未經(jīng)胃蛋白酶消化的ECM應(yīng)用于生物打印構(gòu)建皮膚的研究。為了評(píng)估由mFAECM和細(xì)胞組成的生物打印多層皮膚對(duì)體內(nèi)傷口愈合的影響，該研究在裸鼠中制備了全層皮膚缺損模型。植入后第7天，細(xì)胞負(fù)載組創(chuàng)面面積最小，空白組創(chuàng)面面積最大。第14天，僅細(xì)胞負(fù)載組創(chuàng)面已完全閉合。形態(tài)學(xué)分析表明，生物打印仿生多層皮膚的創(chuàng)面愈合效果最好。H&E染色表明，植入后7天，細(xì)胞負(fù)載組修復(fù)效果優(yōu)于脫細(xì)胞組和空白組。細(xì)胞負(fù)載組大部分表皮結(jié)構(gòu)已形成，脫細(xì)胞組仍被構(gòu)建體覆蓋�？瞻捉M以血痂和脆弱的肉芽組織為主。14天時(shí)，細(xì)胞負(fù)載組和脫細(xì)胞組的表皮結(jié)構(gòu)更加完整。與脫細(xì)胞組相比，細(xì)胞負(fù)載組的真皮結(jié)構(gòu)分布更均勻，血管和纖維組織清晰可見。

圖 3. 全層皮膚缺損小鼠的傷口愈合

4、仿生皮膚增強(qiáng)體內(nèi)血管生成和膠原蛋白合成

組織工程最艱巨的挑戰(zhàn)之一是新血管形成，它與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向目標(biāo)組織的輸送直接相關(guān)。CD31是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，用于評(píng)估傷口愈合過(guò)程中的新毛細(xì)血管。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD31表達(dá)在細(xì)胞負(fù)載組中明顯較高。此外，RT-qPCR 分析顯示，在第7天和第14天，載細(xì)胞組的VEGF表達(dá)明顯高于無(wú)細(xì)胞組和空白組(見補(bǔ)充材料)。因此，可以發(fā)現(xiàn)仿生皮膚通過(guò)促進(jìn)血管生成來(lái)加速傷口愈合。

圖 4. 仿生多層皮膚對(duì)血管形成的影響

膠原蛋白在傷口愈合中起著重要作用，它提供組織強(qiáng)度，并促進(jìn)細(xì)胞粘附和遷移。采用MT染色評(píng)估仿生多層皮膚對(duì)傷口膠原沉積的影響。與空白組相比，植入后第7天和第14天，載細(xì)胞和脫細(xì)胞植入物治療的傷口中觀察到更多的膠原纖維，且排列更有序。第7天，載細(xì)胞組的膠原面積明顯大于脫細(xì)胞組和空白組。第14天，細(xì)胞負(fù)載組膠原面積也明顯高于無(wú)細(xì)胞組和空白組。

圖 5. 仿生多層植入物對(duì)膠原蛋白沉積的影響

5、總結(jié)
該研究描述了一種快速簡(jiǎn)便的方法，直接處理脂肪組織以獲得mFAECM，并將它用作生物墨水的主要成分，以制造生物打印的載細(xì)胞仿生多層皮膚。結(jié)果表明，mFAECM復(fù)合生物墨水具有良好的可打印性和保真度，并能支持細(xì)胞粘附。仿生多層皮膚可以加速傷口愈合。這項(xiàng)研究提供了一種有效的方法來(lái)提高生物打印皮膚替代品的快速制造，這對(duì)于大規(guī)模全層皮膚缺損治療至關(guān)重要。