使用3D生物打印的Hif1a過表達(dá)BMSC水凝膠增強(qiáng)骨折愈合

來源： EngineeringForLife

骨折是一種常見的外傷性骨骼損傷，具有重要的臨床意義，嚴(yán)重影響患者的生命。傳統(tǒng)的治療方法，在某些情況下可以取得良好的效果。然而，在復(fù)雜骨折或長時間愈合過程的治療中，挑戰(zhàn)和局限性仍然存在。

近期，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳愛民主任醫(yī)師聯(lián)合北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院海金醫(yī)師和上海長征醫(yī)院朱磊醫(yī)師團(tuán)隊通過構(gòu)建GBMA@BMSCs水凝膠（GBMA，明膠甲基丙烯酰骨基質(zhì)酸酐；BMSC，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞），探討缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hif1a）基因在骨折愈合過程中對軟骨基質(zhì)的調(diào)節(jié)作用，同時探討該水凝膠在骨折治療中的潛在價值。

相關(guān)研究成果以“Enhancing Fracture Healing with 3D Bioprinted Hif1a-Overexpressing BMSCs Hydrogel: A Novel Approach to Accelerated Bone Repair”為題于2024年11月24日發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》上。

1. 制備適合生物培養(yǎng)的光交聯(lián)BMA水凝膠基質(zhì)材料
脫細(xì)胞骨組織材料的制造過程如圖1A所示。脫細(xì)胞骨組織材料分別用Triton X100和DNase I處理12和24 h。H&E、Masson染色及纖維連接蛋白和膠原蛋白的免疫染色等結(jié)果表明triton X100和DNase I處理12h適合骨組織脫細(xì)胞化（圖1B）。DNA含量下降超過96%（圖1C），硫酸酸化GAG（sGAG）含量（圖1D）和膠原蛋白含量（圖1E）在脫細(xì)胞組織中與原始組織中相同。實時、原位光流分析揭示了BMA剪切存儲模量的時間演變，反映了材料在不同剪切條件下的機(jī)械穩(wěn)定性（圖1F）。此外，對不同交聯(lián)時間點(diǎn)BMA彈性模量的分析表明，隨著交聯(lián)時間的延長，BMA彈性模量顯著增加，表明材料的力學(xué)性能隨著交聯(lián)時間的延長而增強(qiáng)（圖1G）。   

BMA的SEM圖像顯示典型的纖維結(jié)構(gòu)，類似于I型膠原（圖1H）。與甲基丙烯酸酯基團(tuán)交聯(lián)后，BMA表現(xiàn)出共價交聯(lián)水凝膠中常見的多孔微觀結(jié)構(gòu)，隨著交聯(lián)程度的增加，孔徑逐漸減小。用成功分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與BMA水凝膠共培養(yǎng)進(jìn)行的細(xì)胞活力測定顯示，即使在所有樣品中至少培養(yǎng)5天后，細(xì)胞活力也保持在較高水平（圖1I）。在第5天，交聯(lián)15、30和45 s的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的平均存活率分別為92%、94%和91%（圖1J），證實了BMA材料良好的細(xì)胞相容性。這些結(jié)果表明成功制備了一種生物可培養(yǎng)的光交聯(lián)BMA水凝膠基質(zhì)材料。   

圖1 BMA基材料的制備與表征

2. 復(fù)合水凝膠的制備及細(xì)胞生物打印性能研究
為了既能實現(xiàn)3D打印成型，又能保證機(jī)械性能和細(xì)胞活力，研究者選擇將合成的BMA與商業(yè)GelMA結(jié)合起來。然后研究了復(fù)合水凝膠的3D打印成形性、機(jī)械性能和細(xì)胞活力（圖2A）。交聯(lián)前后生物墨水的光學(xué)圖像顯示，隨著BMA濃度的增加，粘度增加，透明度降低。與BMA混合后，水凝膠的內(nèi)部形貌變得粗糙（圖2B）。流變顯示，所有復(fù)合凝膠都有剪切變薄的行為，BMA濃度越高，粘度越高，且水凝膠具有良好的穩(wěn)定性（圖2C-E）。此外，BMA的加入顯著提高了復(fù)合凝膠的壓縮模量（圖2F）。交聯(lián)后，復(fù)合凝膠的膨脹率與BMA含量成反比降低（圖2G），表明BMA濃度越高，交聯(lián)點(diǎn)越密，凝膠孔隙率越低，與SEM結(jié)果一致（圖2B）。降解實驗表明，隨著BMA的加入，降解速度加快（圖2H）。水接觸角測試表明，水接觸角隨著BMA含量的增加而減小（圖2I）。BMA的加入增強(qiáng)了細(xì)胞的流動性（圖2J），活/死細(xì)胞實驗表明紫外線光交聯(lián)是一種細(xì)胞友好的過程，不會導(dǎo)致顯著的細(xì)胞死亡（圖2K-L）。  

圖2 生物墨水的制備與表征   

3. 3D打印GBMA@BMSCs水凝膠增強(qiáng)大鼠骨折愈合
為了研究3D打印GBMA@BMSCs水凝膠在大鼠骨折愈合中的作用，建立了股骨中軸骨折內(nèi)固定模型，觀察水凝膠在愈合過程中的治療效果（圖3A-C）。動態(tài)觀察骨折部位，GBMA@BMSCs組促進(jìn)骨痂和骨形成，在骨折部位建立堅固的橋接，從而產(chǎn)生優(yōu)越的治療效果（圖3D）。術(shù)后第14天的MicroCT 3D重建顯示，GelMA/BMSCs和GBMA@BMSCs水凝膠治療組骨痂形成更多，骨折間隙更�。▓D3E），骨體積/總體積（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）均顯著增加，其中GBMA@BMSCs水凝膠治療組效果更為突出（圖3F）。染色結(jié)果顯示，GelMA/BMSCs和GBMA@BMSCs水凝膠治療組骨面積增大，軟骨面積減小（圖3G-I）。生物力學(xué)分析表明，GelMA/BMSCs和GBMA@BMSCs水凝膠治療促進(jìn)骨折愈合，GBMA@BMSCs水凝膠治療組富含脫細(xì)胞基質(zhì)，提供骨相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)，骨折修復(fù)治療效果比GelMA/BMSCs水凝膠組更顯著（圖3J-L）。   

圖3 植入GBMA@BMSCs水凝膠對大鼠骨折愈合過程的影響

4. GelMA/BMSCs水凝膠T移植對大鼠骨折愈合的機(jī)制研究：Hif1a是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子
隨后，研究者對GelMA/BMSCs水凝膠治療的骨折大鼠進(jìn)行采樣，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并與正常大鼠進(jìn)行比較，分析參與骨折愈合的關(guān)鍵基因（圖4）。結(jié)果顯示，Hif1a表達(dá)在骨折愈合階段顯著上調(diào)，在骨痂形成成骨期達(dá)到峰值，在骨折愈合后期下降。說明在GelMA/BMSCs水凝膠移植骨折愈合過程中，Hif1a可能是一個關(guān)鍵因素。   

圖4 骨折愈合過程生物信息學(xué)分析的關(guān)鍵因素

5. Hif1a在缺氧條件下增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化

骨折愈合最初發(fā)生在缺氧環(huán)境中我們在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，研究了Hif1a對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響（圖5A）。低氧條件下Hif1a過表達(dá)的轉(zhuǎn)染效果更好，因為Hif1a在低氧環(huán)境下更容易被激活和穩(wěn)定（圖5B-C）。細(xì)胞實驗表明，缺氧條件下，細(xì)胞活性減弱，Hif1a過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞在缺氧環(huán)境下生長（圖5D-E）。此外，在常氧和低氧條件下，過表達(dá)Hif1a均能提高ATP水平，在低氧條件下，ATP水平的升高更為顯著，這與Hif1a蛋白表達(dá)一致（圖5F），Hif1a過表達(dá)組乳酸含量顯著增加（圖5G）�；瘜W(xué)需氧量（OCR）在缺氧條件下下降，但在Hif1a過表達(dá)后略有恢復(fù)（圖5H）。   

圖5 Hif1a在缺氧條件下增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性

為觀察缺氧條件下Hif1a過表達(dá)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響，采用不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)P4和P6骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。在成骨誘導(dǎo)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的數(shù)量減少，Hif1a過表達(dá)，成骨相關(guān)基因ALP、Runx2、BMP2的表達(dá)顯著降低（圖6A-C）。在脂肪誘導(dǎo)條件下，Hif1a過表達(dá)導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的數(shù)量減少，導(dǎo)致脂肪生成相關(guān)基因LPL、aP2和PPAR-γ的表達(dá)顯著降低（圖6D-F），提示Hif1a過表達(dá)阻礙了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。在成軟骨誘導(dǎo)條件下，過表達(dá)Hif1a的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，并伴有成軟骨相關(guān)基因SOX9、Col2a1和Agg的顯著上調(diào)（圖6G-I），表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺氧條件下更容易發(fā)生成軟骨分化。   

圖6 缺氧條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的誘導(dǎo)

6. Hif1a在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的過表達(dá)增強(qiáng)軟骨細(xì)胞膠原穩(wěn)定性
然后，研究者將分離的軟骨細(xì)胞與過表達(dá)Hif1a的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，相對于成骨基因和脂肪基因，軟骨相關(guān)基因的表達(dá)顯著增加（圖7A），同時Hif1a過表達(dá)增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活性（圖7B-C）。此外，Hif1a增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞膠原蛋白的穩(wěn)定性，保證了軟骨骨化的進(jìn)展（圖7D-J）。   

圖7 Hif1a對共培養(yǎng)系統(tǒng)的影響

7. Hif1a過表達(dá)促進(jìn)軟骨T轉(zhuǎn)化和骨折愈合
Hif1a可以促進(jìn)骨折愈合，這是一個涉及多個骨骼發(fā)育事件的再生過程，包括軟骨內(nèi)和膜內(nèi)骨化。研究者對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行oe-hif1a處理，制備oe-hif1a處理過的GBMA@BMSCs水凝膠，將其植入骨折大鼠骨髓腔進(jìn)行治療，觀察oe-hif1a對大鼠骨折修復(fù)的影響（圖8）。X射線、組織學(xué)評價、免疫熒光染色、骨體積/組織體積和小梁數(shù)量等結(jié)果顯示，oe- hif1a組軟骨組織生成更多，軟骨轉(zhuǎn)化開始時間更早，軟骨修復(fù)作用更為明顯；也可以促進(jìn)愈合中后期血管重建，從而促進(jìn)新骨形成。   

圖8 oe-hif1a處理GBMA@BMSCs水凝膠對大鼠骨折愈合的影響

綜上，本文利用先進(jìn)的生物3D打印技術(shù)，結(jié)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和仿生水凝膠構(gòu)建方法，建立了一種治療骨折的創(chuàng)新方法。與傳統(tǒng)的骨折治療方法相比，該技術(shù)在定制化、高生物相容性和3D結(jié)構(gòu)復(fù)雜性方面具有優(yōu)勢。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202402415