香港城市大學(xué)胡金蓮院士《AFM》：重組蜘蛛蛋白水凝膠用于生物3D打印和仿生細(xì)胞支架

來源： EngineeringForLife

重組蜘蛛蛋白為創(chuàng)造新的生物材料提供了許多可能性。然而，它們的多態(tài)性和易于聚集的特性在其生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用中都提出了挑戰(zhàn)。香港城市大學(xué)胡金蓮院士及其團(tuán)隊(duì)報(bào)道，突變重組蜘蛛蛋白在37°C和可見光照射下可快速、可控地形成水凝膠。在突變蜘蛛蛋白中，苯丙氨酸殘基（F）被（GGX）重復(fù)序列中的酪氨酸殘基（Y）取代，這有助于β-sheet的自組裝和進(jìn)一步形成淀粉樣納米原纖維。膠束/球狀蜘蛛蛋白溶液轉(zhuǎn)化為由納米原纖維網(wǎng)絡(luò)組成的蜘蛛蛋白水凝膠，隨后通過雙酪氨酸進(jìn)一步交聯(lián)。通過光譜學(xué)、透射電子顯微鏡（TEM）和分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證其構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程。此外，蜘蛛蛋白水凝膠根據(jù)其良好的生物相容性、剪切減薄性能和納米原纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，被用作生物墨水和仿生細(xì)胞支架。本研究結(jié)果揭示了蜘蛛蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化機(jī)制，并擴(kuò)展其在生物醫(yī)學(xué)工程中的應(yīng)用。

相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“Rapidly Forming Recombinant Miniature Spidroins Hydrogels Composed of Nanofibrils with Tunable Mechanical Properties for Bio 3D Printing and Biomimetic Cellular Scaffolds”為題于2024年12月26日發(fā)表在《Advanced Functional Materials》上。  

圖1 工程重組微型蜘蛛蛋白示意圖及其水凝膠形成機(jī)理

圖2 蛋白質(zhì)表達(dá)與分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算   

圖3 水凝膠的制備和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的表征

與蜘蛛蛋白相比，M-蜘蛛蛋白在凝膠形成過程中更容易從膠束/球中轉(zhuǎn)化為β-sheet和淀粉樣納米原纖維，并可以通過雙酪氨酸進(jìn)一步交聯(lián)（圖1c-e）。為了保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性，本研究進(jìn)行了一個(gè)保守突變，用酪氨酸（Y）取代MaSp2中的苯丙氨酸（F），設(shè)計(jì)的蜘蛛蛋白和突變蜘蛛蛋白的核心結(jié)構(gòu)域序列如圖1a所示。微型MaSp2由329個(gè)氨基酸組成，其中MaSp2結(jié)構(gòu)域的一個(gè)重復(fù)區(qū)域位于NT和CT的兩側(cè)（圖1b）。

設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)由大腸桿菌（E. coli）生產(chǎn)，通過固定化金屬親和層析（IMAC）和尺寸排斥色譜柱進(jìn)一步純化，并通過SDS-PAGE進(jìn)行表征（圖2a）。蜘蛛蛋白和突變蜘蛛蛋白制劑的蛋白產(chǎn)率分別為116 ± 14和121±24mg L−1。由于突變，范德華力和靜電相互作用更強(qiáng)，蛋白質(zhì)傾向于自組裝（圖2e）。蜘蛛蛋白/M-蜘蛛蛋白水溶液可以在37℃下快速形成水凝膠，并通過藍(lán)光進(jìn)一步交聯(lián)（圖3a、b）。為研究蜘蛛蛋白在凝膠化過程中的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，首先采用圓二色性（CD）。如圖2b所示，M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白的CD光譜顯示，在208和223 nm處出現(xiàn)強(qiáng)峰，表明蛋白質(zhì)在所有溫度下的構(gòu)象主要是α-螺旋和隨機(jī)螺旋結(jié)構(gòu)。隨著溫度從10°C增加到70°C，兩種蛋白開始展開螺旋，β-sheet的含量從4.15增加到17.61%（圖2c）。蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白在4°C和37 °C水溶液中的快照如圖2d、e所示。此外，還計(jì)算了不同溫度下蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白中2個(gè)REP區(qū)域之間的定向平均相互作用自由能（圖2f、g）。為深入了解M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換過程，應(yīng)用FTIR和XRD光譜對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量訪問（圖3c-j）。M-蜘蛛蛋白和蜘蛛蛋白在水溶液中都以直徑為25 nm的球狀或膠束的形式存在（圖3k）。在37°C孵育1小時(shí)后，蜘蛛蛋白轉(zhuǎn)化為淀粉樣納米原纖維并形成水凝膠（圖3l、m）。交聯(lián)的M-蜘蛛蛋白水凝膠表現(xiàn)為更長(zhǎng)、更薄的納米原纖維的聚集物（圖3n）。   

圖4 水凝膠的力學(xué)性能

滲透斜坡實(shí)驗(yàn)表明，蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白溶液的存儲(chǔ)模量均隨溫度的升高而增加，而隨著溫度降低，存儲(chǔ)模量沒有下降到之前的值，但仍高于損失模量（圖4a），表明形成一種熱不可逆、穩(wěn)定的水凝膠。此外，M-蜘蛛蛋白溶液可以在可見光控制下的2 min內(nèi)形成水凝膠（圖4b）。從SEM圖像中觀察到水凝膠的孔隙大小約為10μm（圖4c、d）。在恒定頻率為1rad s−1下進(jìn)行的振蕩振幅掃描顯示，這些水凝膠樣品在0.1-5%的應(yīng)變范圍內(nèi)具有彈性。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度從150mg下降到50 mg mL−1時(shí)，線性粘彈性區(qū)域從9%轉(zhuǎn)移到3%（圖4e）。通過控制蛋白質(zhì)的濃度，可以很容易調(diào)整水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度（圖4f）。與本研究結(jié)果相比，之前報(bào)道的凝膠化時(shí)間更長(zhǎng)，凝膠化溫度明顯更高，并且所得到的水凝膠通常不透明（圖4g）。

圖5 蜘蛛蛋白水凝膠作為生物墨水和細(xì)胞支架的演示

本研究進(jìn)一步證明了M-蜘蛛蛋白適用于生物技術(shù)應(yīng)用（圖5）。采用振蕩剪切流變學(xué)分析方法，對(duì)M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白水凝膠在交聯(lián)前的可打印性進(jìn)行評(píng)價(jià)。所有濃度的水凝膠都表現(xiàn)出剪切變薄行為（圖5a）。高應(yīng)變振蕩（200%）使水凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)楦�具粘性的狀態(tài)（圖5b）�；�于剪切稀釋和恢復(fù)性能，M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白水凝膠適用于3D打印，因此打印了支架，并根據(jù)針的尺寸、打印速度和壓力等優(yōu)化打印條件（圖5c、d）。用小鼠胚胎纖維母細(xì)胞評(píng)價(jià)M-蜘蛛蛋白生物墨水的細(xì)胞活力和增殖能力。與商用的絲素纖維蛋白生物墨水相比（圖5e-g），M-蜘蛛蛋白生物墨水具有更高的活力（>95%），并與絲素生物墨水一樣增殖。然后將M-蜘蛛蛋白與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）混合，采用不同的處理方法制備生物墨水。四個(gè)小塊和一個(gè)水凝膠的“CITYU”圖案通過可見光固化（圖5h）�！癈ITYU”水凝膠用CD31和Hoechst染色（圖5i）。用Calcein/PI染色，共聚焦顯微鏡觀察兩種圖案水凝膠。由于納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)5天后觀察到90%以上的細(xì)胞活力（圖5j）。對(duì)于生物3D生物打印，將細(xì)胞裝入M-蜘蛛蛋白溶液中，在擠壓前以37°C孵育60分鐘，該支架由機(jī)械臂打印，并通過藍(lán)光進(jìn)一步固化（圖5k）。免疫染色分析的結(jié)果證實(shí)HUVECs在第7天表達(dá)CD31（圖5i-m）。以上結(jié)果表明，M-蜘蛛蛋白兼容不同的模式方法，并支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。   

全文小結(jié)
綜上所述，本研究制備了一種基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的微型重組蜘蛛蛋白水凝膠，可應(yīng)用于生物3D打印和細(xì)胞支架。揭示了凝膠化過程中蜘蛛蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的機(jī)理，并通過CD、FTIR、XRD譜、TEM和理論計(jì)算進(jìn)行驗(yàn)證。高濃度的M-蜘蛛蛋白（膠束結(jié)構(gòu)）可轉(zhuǎn)化為淀粉樣納米原纖維，誘導(dǎo)水凝膠形成，并可通過雙酪氨酸進(jìn)一步交聯(lián)。因此，M-蜘蛛蛋白可以非常迅速地形成水凝膠，交聯(lián)水凝膠表現(xiàn)出可調(diào)的力學(xué)性能。此外，本研究還展示了M-蜘蛛蛋白作為生物墨水進(jìn)行3D打印的應(yīng)用，以及與ECM相似的納米纖絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。由結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化衍生而來的M-蜘蛛蛋白水凝膠的概念為創(chuàng)建具有先進(jìn)特性的功能化水凝膠提供可能性，可用于廣泛的應(yīng)用，如酶的錨定、可控藥物釋放和組織工程。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202420059