原位發(fā)泡和3D打印多孔支架在傷口愈合中的優(yōu)勢

來源： EFL生物3D打印與生物制造

大孔水凝膠在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中顯示出巨大的潛力，特別是在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這歸功于它們增強(qiáng)的營養(yǎng)和廢物滲透性、改善的細(xì)胞通透性和最小的免疫原性。然而，傳統(tǒng)制造多孔水凝膠的方法需要二次后處理步驟或有害試劑，這使得與生物活性因子和細(xì)胞同時(shí)制造變得不可能。

來自美國康涅狄格大學(xué)健康中心的 Ali Tamayol等團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種手持打印機(jī)，用于方便且連續(xù)地生成和沉積水凝膠泡沫，直接在皮膚缺損處形成特定于缺陷的大孔支架。在該手持系統(tǒng)中，一個(gè)溫度控制的微流控均質(zhì)器與微型液體和空氣泵相結(jié)合，以所需比例將無菌空氣與明膠甲基丙烯酰基（GelMA）混合。然后利用集成的光交聯(lián)單元在原地交聯(lián)打印的泡沫，形成具有控制孔隙率的支架。該系統(tǒng)被優(yōu)化以形成可靠且均勻的GelMA泡沫。所得泡沫支架展現(xiàn)出優(yōu)異的機(jī)械性能和靈活性，使它們適用于傷口愈合應(yīng)用。體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，與實(shí)體水凝膠相比，支架上的細(xì)胞活性顯著增加。體內(nèi)打印的泡沫支架提高了小鼠全層傷口的愈合速度和質(zhì)量，無需使用生物材料。相關(guān)工作以題為“Benefits of In Situ Foamed and Printed Porous Scaffolds in Wound Healing”的文章發(fā)表在2024年09月09日的期刊《Advanced Healthcare Materials》。

1.創(chuàng)新型研究內(nèi)容
本文開發(fā)了一個(gè)系統(tǒng)，通過整合i) 一個(gè)溫控的現(xiàn)場打印機(jī)，ii) 一個(gè)空氣泵和iii) 一個(gè)微流體均質(zhì)機(jī)，以同時(shí)生成并打印高度可控的多孔泡沫支架，用于治療皮膚傷口（圖1）。在這種方法中，GelMA水凝膠前體和空氣分別通過線性執(zhí)行擠壓系統(tǒng)和空氣泵，流入微流體均質(zhì)機(jī)，在這里，氣泡被引入GelMA流中并通過連續(xù)的氣泡分裂實(shí)現(xiàn)均質(zhì)化（圖1A）。這種膠體乳液隨后通過出口噴嘴，被現(xiàn)場打印到缺損部位，并隨即與內(nèi)置的光交聯(lián)單元交聯(lián)。多孔泡沫的即時(shí)打印和光交聯(lián)阻止了氣泡的不穩(wěn)定性及合并。這種方法便于處理不規(guī)則形狀的傷口以及曲面上的傷口，并且無縫形成大孔支架，這些支架能夠適應(yīng)并粘附于剩余組織上。泡沫的相互連接的大孔結(jié)構(gòu)，如掃描電子顯微鏡（SEM）所顯示的，改善了細(xì)胞浸潤、增殖和組織重塑（圖1A）。緊湊的設(shè)備（圖1B）使其可以在資源有限的環(huán)境中作為手持式打印機(jī)使用，同時(shí)該設(shè)備也可以安裝到自動(dòng)控制系統(tǒng)上，如機(jī)械臂，以實(shí)現(xiàn)更精確、高分辨率的植入物輸送。此外，本文的平臺(tái)不依賴手動(dòng)擠壓，并允許進(jìn)一步自動(dòng)化。

手持式一步法泡沫打印機(jī)的發(fā)展
圖1B展示了開發(fā)的一步法原位泡沫打印機(jī)。該系統(tǒng)由五個(gè)集成模塊組成（水凝膠前體溫度控制系統(tǒng)、電動(dòng)水凝膠前體擠出系統(tǒng)、微型氣泵、微流控均質(zhì)器和光交聯(lián)照明系統(tǒng)），這些模塊被封裝在一個(gè)外殼中，使整個(gè)系統(tǒng)成為一個(gè)緊湊的移動(dòng)設(shè)備（圖1C）。模塊化設(shè)計(jì)便于快速簡便地組裝和拆卸打印機(jī)，以及迅速更換前體注射器盒。此外，系統(tǒng)的模塊化還使得維護(hù)或修改變得簡單，例如使用不同尺寸的前體注射器盒、不同類型的電機(jī)或任何未來的升級，而無需重新設(shè)計(jì)整個(gè)系統(tǒng)。組裝好的設(shè)備體積�。ㄖ鳈C(jī)箱尺寸：18 × 5 × 4厘米）且重量輕（278克），可以用一只手輕松操作和控制（圖1B）。   

圖1 一步法原位打印大孔支架用于皮膚傷口組織再生

微流控均質(zhì)器的設(shè)計(jì)及泡沫孔隙率優(yōu)化
緊湊型微流控均質(zhì)器被設(shè)計(jì)并制造出來，以便于水凝膠前體的一步式充氣過程（圖2A）。這些均質(zhì)器通過組裝三個(gè)部件制成：一個(gè)三通連接器、一個(gè)微網(wǎng)組件和用于連接的魯爾鎖接頭。特別設(shè)計(jì)的三通連接器使用魯爾鎖接頭進(jìn)行快速連接；兩個(gè)凸形魯爾鎖被用于水凝膠和空氣輸入，而一個(gè)下游凹形連接器被用于微網(wǎng)組件的附著（圖2A）。空氣通過一個(gè)包含三個(gè)通道的微流控混合器引入到水凝膠前體流中。本文的初步實(shí)驗(yàn)表明，這些通道比單通道設(shè)置更有效地引入并將空氣混合入水凝膠流中，從而產(chǎn)生更均勻且質(zhì)量更高的泡沫。第二個(gè)組件是微網(wǎng)組件，由多個(gè)尼龍微網(wǎng)組成，彼此間隔1毫米，用于順序氣泡分裂。在擠出含有大氣泡的GelMA水凝膠前體通過微網(wǎng)組件時(shí)，水相輕松流過網(wǎng)格，而氣泡經(jīng)歷剪切應(yīng)力迫使它們順序分裂，直到形成均勻細(xì)膩的GelMA泡沫為止（圖2B）。這將在沉積和原位光交聯(lián)后在支架中形成均勻的大孔。微網(wǎng)組件的配置，包括網(wǎng)孔大小和網(wǎng)層數(shù)量，決定了打印泡沫的孔隙率和孔徑分布。通過改變進(jìn)氣壓力和生物材料濃度、溫度及前體擠出速率，可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)孔徑和孔隙率。對孔隙結(jié)構(gòu)的這種控制程度是非常寶貴的，也是這項(xiàng)工作相較于以往研究的主要優(yōu)勢之一。微流控均質(zhì)器的最后一個(gè)組件是一個(gè)凹形魯爾鎖末端，用于快速連接到不同尺寸或形狀的打印針頭和噴嘴。

圖2 微流控均質(zhì)器的設(shè)計(jì)及參數(shù)優(yōu)化使得能夠生成具有可控孔徑的多孔水凝膠

一步發(fā)泡和打印的演示
由于發(fā)泡過程的自動(dòng)化以及對過程參數(shù)的控制，這一過程具有高度的重復(fù)性，并且能夠很好地控制打印泡沫的孔隙率和孔徑分布。該系統(tǒng)旨在用于手動(dòng)打印，或者可以安裝在機(jī)械臂上以實(shí)現(xiàn)大孔支架的全自動(dòng)一步打�。▓D3）。緊湊的系統(tǒng)能夠同時(shí)生成、打印和光交聯(lián)多孔泡沫水凝膠支架。手持式系統(tǒng)被封裝在一個(gè)符合人體工程學(xué)的外殼中，易于長時(shí)間握持和操作（圖3A）。其小尺寸和輕重量使其成為外科醫(yī)生在手術(shù)室或資源有限的環(huán)境中（如戰(zhàn)場）使用的理想設(shè)備。操作者能夠操縱噴嘴尖端覆蓋非均勻幾何形狀和曲面上的傷口，無需增加醫(yī)療成像或掃描、計(jì)算處理或工具路徑生成的復(fù)雜性。重要的是，它通過消除對額外固定的需要，解決了傳統(tǒng)植入柔軟水凝膠支架的挑戰(zhàn)，因?yàn)樵谠�位交�?lián)時(shí)支架會(huì)粘附在組織上。為了便于填充各種幾何形狀的缺損，本文利用了各種市售或定制設(shè)計(jì)的噴嘴幾何形狀（圖3B）。本文創(chuàng)建了一個(gè)離體的硅膠皮膚模型，以展示該設(shè)備打印和填充各種大小和幾何形狀缺損的能力。帶有魯爾鎖端的商用噴嘴，如傳統(tǒng)的鈍頭金屬針，可以安裝到微流體均質(zhì)器的末端，用于填充狹窄的傷口。此外，本文還設(shè)計(jì)并3D打印了一個(gè)定制的平扇噴嘴，帶有魯爾鎖耦合，用于以條狀模式原位沉積大孔支架，快速填充大面積缺損。本文還開發(fā)了一個(gè)大圓形噴嘴，用于快速填充大面積的圓形缺損，如皮膚活檢產(chǎn)生的缺損。

圖3 手持式和自動(dòng)化原位打印的演示   

一步法打印大孔支架的物理表征
接下來，本文評估了一步法制備的多孔支架的機(jī)械性能和生物降解性能，并將其與實(shí)體GelMA進(jìn)行了比較。為了評估機(jī)械性能，進(jìn)行了軸向壓縮力學(xué)測試（圖4A）。通過結(jié)果應(yīng)力-應(yīng)變曲線前10%的斜率，本文量化了實(shí)體和泡沫水凝膠的壓縮模量（圖4B）。壓縮測試顯示，泡沫的壓縮模量與本研究團(tuán)隊(duì)之前報(bào)道的通過機(jī)械攪拌生成的GelMA泡沫相似，接近軟組織的值。然而，正如預(yù)期的那樣，與實(shí)體15% GelMA水凝膠相比（約5 kPa vs 約50 kPa），泡沫的壓縮模量顯著較低。由于水凝膠的機(jī)械性能受其孔隙率的顯著影響，因此一步法發(fā)泡器對孔隙率的控制能力是一個(gè)重要的因素，可用于解耦細(xì)胞經(jīng)歷的微觀壓縮模量和組織或宏觀層面感受到的硬度。本文進(jìn)一步證明，泡沫具有高度的可變形性（圖4C），并且在加載后能夠恢復(fù)其原始幾何形狀。此外，進(jìn)行了循環(huán)壓縮測試以評估支架的機(jī)械滯后性和對類似于生理體動(dòng)的重復(fù)加載的彈性。測試在約50%的應(yīng)變下進(jìn)行了多達(dá)20個(gè)循環(huán)的循環(huán)壓縮。支架展示了一致的滯后行為。具體來說，在最初的三個(gè)循環(huán)后，加載和卸載曲線沒有觀察到明顯的變化，表明具有良好的可恢復(fù)性（圖4D）。這對于在身體運(yùn)動(dòng)期間經(jīng)歷大應(yīng)變的軟組織植入物來說是至關(guān)重要的。   

圖4 一步打印法生產(chǎn)的泡沫與實(shí)體水凝膠的物理性能比較

體外生物學(xué)特性表征
為評估多孔支架的生物特性，本文將這些支架暴露于人類真皮成纖維細(xì)胞(HDF)培養(yǎng)中。此處選擇HDFs有三個(gè)特定原因：它們作為初級細(xì)胞對細(xì)胞毒性環(huán)境的敏感性、它們在再生醫(yī)學(xué)中的人源相關(guān)性，以及它們對體內(nèi)傷口愈合實(shí)驗(yàn)的適用性。首先，制作了支架，并在支架上播種了細(xì)胞以評估支架的生物行為。這項(xiàng)調(diào)查旨在仔細(xì)檢查一步打印泡沫的生物相容性和適宜性，以用于容納細(xì)胞，同時(shí)也在體外環(huán)境中反映本文最終的體內(nèi)策略。對于細(xì)胞播種研究，使用PrestoBlue活性檢測法評估了五天跨度內(nèi)的細(xì)胞增殖和存活率。正如圖5A所示，熒光強(qiáng)度測量表明，在五天的時(shí)間里，接受一步打印泡沫和實(shí)體水凝膠處理的細(xì)胞代謝活動(dòng)呈現(xiàn)一致的線性增加。有趣的是，PrestoBlue檢測顯示，與實(shí)體水凝膠相比，播種在一步打印泡沫樣本上的細(xì)胞表現(xiàn)出顯著更高的增殖。增加的增殖可能是由于一步打印泡沫結(jié)構(gòu)的多孔性質(zhì)，為細(xì)胞生長提供了更多空間，并在3D構(gòu)建物內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖。這種行為通過Actin/DAPI染色培養(yǎng)物得到了證實(shí)（圖5B,C）。雖然實(shí)體水凝膠具有生物相容的表面，并有明顯的細(xì)胞增殖和擴(kuò)散，但其小的內(nèi)在孔隙限制了細(xì)胞向水凝膠內(nèi)的滲透，促使細(xì)胞在樣本表面形成密集的平面層（圖5B）。相反，培養(yǎng)在多孔支架上的HDFs形成了在三維中生長的多層結(jié)構(gòu)，形成了細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（圖5C）。HDFs的非平面性質(zhì)通過細(xì)胞向下生長進(jìn)入孔隙中的聚焦絲狀擴(kuò)散顯示出來，顯微照片中較暗的部分顯示了這一點(diǎn)。   

圖5 一步法打印大孔支架的體外生物學(xué)表征

體內(nèi)打印支架以治療皮膚傷口
在誘導(dǎo)全層傷口后，傷口要么作為對照不進(jìn)行治療，要么用固體GelMA水凝膠或一步式打印的GelMA泡沫進(jìn)行治療（圖6A）。所有傷口都用半透性的Tegaderm薄膜覆蓋以防止感染。傷口被成像12天以進(jìn)行定量。有趣的是，盡管使用了化學(xué)上相同的材料來制作固體水凝膠和泡沫，但這些組在整個(gè)研究中觀察到的傷口閉合情況卻有顯著不同（圖6B,C）。12天后，用固體水凝膠和泡沫支架治療的傷口閉合率分別為54%對88%。無論是定量（圖6B）還是定性（圖6C），結(jié)果都表明，與Tegaderm對照組或多孔泡沫相比，添加固體水凝膠會(huì)阻礙傷口閉合。這與之前的研究結(jié)果一致，并表明具有非常小孔徑的固體水凝膠無法容易被生物降解和侵入再生及免疫細(xì)胞。本文的體外降解和細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)一步支持這一事實(shí)。另一方面，大孔泡沫使得降解和細(xì)胞浸潤變得容易，并且與固體支架相比顯著加速了傷口閉合（圖6B,C）。雖然這項(xiàng)研究旨在開發(fā)一步式原位泡沫打印作為一種平臺(tái)技術(shù)，將來可以與各種生物因子的傳遞相結(jié)合以促進(jìn)傷口愈合，但泡沫支架本身在傷口閉合方面就超過了Tegaderm對照組，在第9天時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。   

圖6 全層傷口的鼠模型，用于展示一步法打印泡沫在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)上的可行性和再生潛力

在實(shí)驗(yàn)的第12天結(jié)束時(shí)，進(jìn)行了組織學(xué)分析以評估傷口愈合的質(zhì)量（圖7）。蘇木精和伊紅（H&E）以及馬松三色（MT）染色（圖7A）顯示所有組都有愈合的證據(jù)。然而，用泡沫處理的傷口顯示出更成熟和先進(jìn)的愈合跡象，如較厚的肉芽組織和毛囊的生長更多地向缺損中心進(jìn)展所證明。相反，水凝膠組中的實(shí)體水凝膠通過物理阻擋傷口邊緣的進(jìn)展而阻礙了傷口閉合（圖7A，紅色箭頭）。這證實(shí)了本文的假設(shè)，即實(shí)體水凝膠具有較慢的生物降解性，不允許細(xì)胞輕易滲透和支架重塑，而通過應(yīng)用大孔泡沫支架可以解決這一問題。肉芽組織厚度的定量測量確認(rèn)了相同的模式，即用一步法打印的大孔泡沫處理的傷口傾向于形成更厚的肉芽，盡管這種差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7B）。   

圖7 用大孔泡沫支架治療皮膚傷口后，通過組織學(xué)分析評估傷口愈合質(zhì)量

2.總結(jié)與展望
這項(xiàng)研究為組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步研究開辟了許多途徑。未來的調(diào)查可以探索其他生物材料、生物墨水配方以及超出皮膚傷口愈合之外的使用指征。對打印參數(shù)的微調(diào)和其他潛在醫(yī)療應(yīng)用的探索將有助于擴(kuò)展這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。此外，為了使這項(xiàng)技術(shù)適用于治療大面積傷口，可以不使用步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的注射器，而是將墨盒外部放置，連接到蠕動(dòng)泵上，以支持在更大規(guī)模和資源匱乏地區(qū)的使用�？紤]到產(chǎn)生的泡沫體積是儲(chǔ)存墨盒體積的三倍，可以在保持策略便攜性的同時(shí)生成大體積的治療泡沫。所提出的一步式原位生物打印方法在克服固體水凝膠基支架制造中現(xiàn)有局限性方面邁出了重要一步。精確度、可重復(fù)性和多功能性的結(jié)合使這項(xiàng)技術(shù)成為推進(jìn)再生醫(yī)學(xué)和組織工程的有前景的轉(zhuǎn)化工具。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202401944