體素化生物3D打印構(gòu)建模塊化雙網(wǎng)絡(luò)生物墨水微滴

來源：EFL生物3D打印與生物制造

當(dāng)前生物制造領(lǐng)域在構(gòu)建三維組織時(shí)面臨關(guān)鍵挑戰(zhàn)：傳統(tǒng)生物打印技術(shù)難以精準(zhǔn)操控高粘彈性生物墨水體素在三維空間中的組裝，且單一網(wǎng)絡(luò)水凝膠存在力學(xué)性能可調(diào)性有限、細(xì)胞相容性不足等問題。例如，基于海藻酸鹽的單網(wǎng)絡(luò)水凝膠脆性高、力學(xué)強(qiáng)度不足，而傳統(tǒng)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠常依賴細(xì)胞毒性交聯(lián)劑（如丙烯酰胺自由基聚合），限制了其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。   

來自美國弗吉尼亞大學(xué)的Li-Heng Cai教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了**體素化生物打印技術(shù)（DASP 2.0）**，通過設(shè)計(jì)無添加劑的生物友好型點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)（降冰片烯-四嗪配對），實(shí)現(xiàn)了聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）或透明質(zhì)酸/海藻酸鹽（HA/Alg）雙網(wǎng)絡(luò)生物墨水微滴的數(shù)字組裝。該技術(shù)利用多通道打印噴嘴實(shí)現(xiàn)高粘彈性墨水的按需混合，避免細(xì)胞損傷，并通過調(diào)控雙網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)動力學(xué)和力學(xué)性能（如剛度、延展性），成功構(gòu)建了復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)（如空心球體、陀螺狀多孔支架）。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其細(xì)胞相容性，體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)顯示支架在小鼠腹腔內(nèi)可維持120天結(jié)構(gòu)完整性。   

相關(guān)工作以“Voxelated bioprinting of modular doublenetwork bio-ink droplets”為題發(fā)表在《Nature Communications》上。

1. 數(shù)字組裝球形顆粒（DASP）構(gòu)建模塊化雙網(wǎng)絡(luò)生物墨水微滴，通過開發(fā)基于聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）和透明質(zhì)酸/海藻酸鹽（HA/Alg）的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，結(jié)合無添加劑點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)（降冰片烯-四嗪交聯(lián)）和多通道打印噴嘴，研究了高粘彈性生物墨水體素的三維精準(zhǔn)組裝及力學(xué)性能調(diào)控。結(jié)果表明，DASP 2.0技術(shù)可制備互連且可區(qū)分的水凝膠顆粒構(gòu)建的復(fù)雜結(jié)構(gòu)（如空心球體），雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的剛度和延展性可通過聚合物濃度和交聯(lián)比例調(diào)控，且細(xì)胞封裝存活率達(dá)60%以上。      

圖1. 數(shù)字組裝球形顆粒（DASP）的雙網(wǎng)絡(luò)生物墨水微滴構(gòu)建流程。   

2. 單網(wǎng)絡(luò)聚酰胺（PAM）水凝膠的交聯(lián)動力學(xué)與剛度表征，通過流變學(xué)測試和理論模型分析，研究了不同NB/TZ比例和聚合物濃度對PAM水凝膠交聯(lián)時(shí)間和剪切模量的影響。結(jié)果表明，凝膠時(shí)間隨NB/TZ比例增加呈指數(shù)下降，剪切模量與聚合物濃度呈冪律關(guān)系（G∝c^2.1），理論模型（G≈kBT/ξ³）可較好描述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，揭示了點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的動力學(xué)規(guī)律和網(wǎng)絡(luò)形成機(jī)制。      

圖2. 單網(wǎng)絡(luò)PAM水凝膠的交聯(lián)動力學(xué)與剛度表征。   

3. 雙網(wǎng)絡(luò)（DN）聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）水凝膠的力學(xué)性能，通過動態(tài)剪切和單軸拉伸測試，研究了雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對水凝膠剛度和延展性的協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果表明，DN水凝膠的剪切模量約為單網(wǎng)絡(luò)組分之和（如PAM₁₀Alg₂的G=11 kPa），拉伸斷裂應(yīng)變（εf=1.0）較單網(wǎng)絡(luò)PAM（εf=0.36）提升近3倍，歸因于弱網(wǎng)絡(luò)（海藻酸鹽）先斷裂分散應(yīng)力的機(jī)制。      

圖3. 雙網(wǎng)絡(luò)PAM/Alg水凝膠的剛度與延展性分析。   

4. 雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的體素化生物打印與機(jī)械性能測試，通過開發(fā)雙入口打印噴嘴和靜態(tài)混合腔，研究了DASP 2.0打印復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)（如空心球體、陀螺狀支架）的能力及循環(huán)壓縮下的力學(xué)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，打印的空心球體由42個(gè)互連顆粒組成，陀螺狀支架可承受60%壓縮應(yīng)變并完全恢復(fù)，能量耗散效率僅27.5%，顯示出高彈性和結(jié)構(gòu)完整性。   

圖4. 雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的3D打印結(jié)構(gòu)及其循環(huán)壓縮性能。   

5. 體素化打印雙網(wǎng)絡(luò)支架的細(xì)胞相容性與體內(nèi)穩(wěn)定性，通過三通道噴嘴封裝Beta-TC-6細(xì)胞并移植到小鼠腹腔，研究了支架的體外細(xì)胞存活、胰島素分泌功能及體內(nèi)長期穩(wěn)定性。結(jié)果表明，打印后細(xì)胞存活率為61.3%±8.0%，3天后仍維持60%以上活性，且支架在體內(nèi)120天未降解，結(jié)構(gòu)完整，證實(shí)其生物相容性和機(jī)械魯棒性。      

圖5. 雙網(wǎng)絡(luò)支架的細(xì)胞封裝、功能驗(yàn)證與體內(nèi)移植結(jié)果。   

6. 透明質(zhì)酸/海藻酸鹽（HA/Alg）雙網(wǎng)絡(luò)生物墨水的普適性研究，通過替換聚酰胺為透明質(zhì)酸（HA）聚合物，研究了不同生物基雙網(wǎng)絡(luò)墨水的打印適應(yīng)性和細(xì)胞相容性。結(jié)果表明，HA/Alg雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的剪切模量（3050 Pa）和拉伸應(yīng)變（εf=1.02）與PAM/Alg相當(dāng)，細(xì)胞存活率提升至80%以上，且體內(nèi)移植30天結(jié)構(gòu)保持完整，驗(yàn)證了該技術(shù)平臺的通用性。      

圖6. HA/Alg雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的力學(xué)性能、打印性與生物相容性。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)的體素化生物打印技術(shù)（DASP 2.0）通過生物友好型點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)和多通道噴嘴設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了雙網(wǎng)絡(luò)生物墨水微滴的精準(zhǔn)組裝與力學(xué)性能調(diào)控。研究表明，聚酰胺/海藻酸鹽（PAM/Alg）和透明質(zhì)酸/海藻酸鹽（HA/Alg）雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠可通過調(diào)節(jié)聚合物濃度和交聯(lián)比例，獲得范圍廣泛的剛度（400 Pa至22 kPa）和延展性（拉伸斷裂應(yīng)變達(dá)1.0），并成功打印出空心球體、陀螺狀支架等復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。體外細(xì)胞封裝實(shí)驗(yàn)顯示，支架可維持Beta-TC-6細(xì)胞60%以上存活率并保留胰島素分泌功能；體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)，支架在小鼠腹腔內(nèi)120天仍保持結(jié)構(gòu)完整，力學(xué)性能穩(wěn)定。此外，透明質(zhì)酸基雙網(wǎng)絡(luò)墨水的細(xì)胞相容性提升至80%，拓展了該技術(shù)在生物制造中的應(yīng)用潛力。本研究為構(gòu)建高復(fù)雜度功能性組織工程支架提供了新策略。

文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-49705-z