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Biomaterials science|牛津大學工程科學系生物醫(yī)學工程研究所江卓然博士在具有功能...

3D打印前沿
2024
10/22
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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]載細胞生物打印是一種很有前途的生物制造策略,用于再生生物活性移植以解決器官供體短缺問題。然而,在復制具有多種獨特細胞類型和生理相關(guān)結(jié)構(gòu)的可移植人工器官方面幾乎沒有成功。近日,牛津大學工程科學系生物醫(yī)學工程研究所江卓然博士[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]提出了全向打印嵌入式網(wǎng)絡(OPEN)作為嵌入式3D打印的支持介質(zhì)[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]。該文章名為“ Liver bioprinting within a novel support medium with functionalized spheroids, hepatic vein structures, and enhanced post-transplantation vascularization[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]”,發(fā)表在 Biomaterials science [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]上。提出了全向打印嵌入式網(wǎng)絡(OPEN)作為嵌入式3D打印的支持介質(zhì)。該填料具有一步制備、快速去除和多種墨水兼容性,因此具有最先進的技術(shù)。為了測試OPEN的可行性,使用特殊的原代小鼠肝細胞(PMH) 和內(nèi)皮細胞系C166按照預先設計的基于解剖學的打印路徑打印具有靜脈結(jié)構(gòu)的肝球封裝人工肝臟(HEALs)在OPEN中。PMHs在墨水基質(zhì)內(nèi)自組織成肝細胞球體,而整個交聯(lián)結(jié)構(gòu)在至少10天的培養(yǎng)中保持完整。培養(yǎng)的HEAL在體外保持成熟的肝功能和標志基因表達,高于傳統(tǒng)的2D和3D條件。與僅肝球狀體肝印相比,具有C166負載靜脈結(jié)構(gòu)的HEAL在移植后2周內(nèi)促進了體內(nèi)內(nèi)源性新生血管形成。總的來說,所提出的平臺能夠制造類似于解剖結(jié)構(gòu)的生物活性組織或器官,并對臨床應用中的肝功能替代具有廣泛的影響。


一、背景介紹
生物打印旨在使用特定的活細胞制造生物活性組織或器官,用于治療疾病或測試方式 。人們在設計細胞類型、細胞材料生態(tài)位和再生方法方面做出了廣泛的努力。然而,直接打印載有細胞的生物墨水以在體外重建功能和結(jié)構(gòu)完整的器官或組織可能是一項挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)上,采用基于擠出的生物打印,其中載有細胞的生物墨水逐層打印。此過程不可避免地限制了打印量和細胞數(shù)。生物墨水的開發(fā)工作試圖通過改變墨水材料的化學和流變特性來增強細絲的自跨越能力,以實現(xiàn)體積增量。不幸的是,這種方法通常會損害細胞性能。為了克服這些限制,嵌入式打印(涉及在抵消重力和表面張力的支撐介質(zhì)中進行3D打印)已被應用于打印組織、軟機器人、生物傳感器和醫(yī)療設備。這種替代方法允許設計和構(gòu)建精的細體內(nèi)結(jié)構(gòu)(如脈管系統(tǒng)和空化)。除了設計自上而下的生物制造方法外,還必須正確選擇特定的細胞來源,以便再生目標組織或器官。
將自上而下的嵌入式生物打印與自下而上的細胞自組織相結(jié)合的最新進展導致了厚血管化組織的發(fā)展。血管化的心臟組織由于其固有的血管層次結(jié)構(gòu)而具有特別的興趣。盡管這些進步代表了器官打印的重大進展,但它們在體外和體內(nèi)同時維持細胞功能和復制組織結(jié)構(gòu)的能力有限,從而限制了它們作為移植替代品的潛力。此外,心臟和腸道等空心器官比肝和腎等實質(zhì)器官更容易構(gòu)建,因為實質(zhì)器官執(zhí)行完整的生理功能,需要適當?shù)募毎Y源、完整的細胞-細胞外基質(zhì)(ECM)整合和血管化。例如,肝細胞群由實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞組成。肝細胞約占總體肝臟細胞的70 %,并執(zhí)行肝臟的主要生理功能。由于肝臟的復雜性,肝臟3D打印的大多數(shù)研究都集中在用于術(shù)前可視化的脫細胞手術(shù)模型重建上。在3D自組裝的微型肝臟中發(fā)現(xiàn)其延長了小鼠肝衰竭模型的存活率。這項研究推進了3D肝組織作為肝臟疾病的治療選擇。
在這項研究中,旨在使用自組織肝細胞構(gòu)建塊通過嵌入式生物打印構(gòu)建三維、功能性和可移植的肝球狀體封裝人工肝臟(HEALs)。嵌入式打印程序包括兩個步驟:在支撐物內(nèi)擠出油墨以形成設計結(jié)構(gòu),然后去除支撐介質(zhì)以保持所需的結(jié)構(gòu)。去除步驟通常很難在不破壞打印結(jié)構(gòu)的情況下進行,尤其是當打印件具有精細的脈管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)時。為了實現(xiàn)復雜的器官打印,開發(fā)了一種基于疏水相互作用的聚合物網(wǎng)絡作為支持介質(zhì)。提出的支持介質(zhì)稱為全向打印嵌入式網(wǎng)絡(OPEN),其主要特點包括:制備簡單、直接去除支撐物以及與不同生物墨水的兼容性,同時保持支撐穩(wěn)定性、精確打印能力和生物相容性(圖 1A)。然后將明膠-甲基丙烯酸酯(GelMA)與OPEN結(jié)合,以創(chuàng)建用于組織重建的載細胞打印件。使用原代小鼠肝細胞(PMH)作為肝功能重建的肝細胞組成部分,其來源培養(yǎng)基可以在體外誘導肝球狀體形成。為了創(chuàng)建載有細胞的靜脈結(jié)構(gòu)并誘導移植后血管形成,小鼠內(nèi)皮細胞系C166作為靜脈生物墨水封裝在GelMA中(圖1B和C)。所得打印的肝臟稱為HEAL (圖1D)。每個HEAL層的打印路徑都是根據(jù)節(jié)段肝臟解剖結(jié)構(gòu)預先設計的,因此雙噴嘴打印可以相應地準確地重建肝臟段和靜脈(圖1E)。在體外證明了功能性肝細胞球體的形成以及標志物蛋白表達和肝功能。此外,與傳統(tǒng)肝細胞培養(yǎng)物相比,打印的肝球體的基因表達與新鮮分離的PMH表現(xiàn)出更好的相似性,這意味著在原位肝移植中使用HEAL的潛力更高。我們還證明HEALs是可移植的,并且可以通過募集內(nèi)皮細胞和生長因子顯著誘導內(nèi)源性新生血管形成。


圖1 .通過嵌入式3D打印實現(xiàn)可移植和生物活性的微型肝臟。(A)利用Pluronic® F-127(PF127)和疏水改性羥丙基甲基纖維素(H-HPMC)之間的疏水結(jié)合的一步法OPEN制備的示意圖。(B)PMH的分離、2D增殖以及PMH和C166的配對生物墨水制備。(C)從體外異質(zhì)性嵌入生物打印到體內(nèi)移植的生物活性微型肝再生過程的逐步表示。(D)用紅色或象牙色染料染色的印刷結(jié)構(gòu)的圖像。(i)HEAL的前視圖,包含一個格子狀的迷你肝臟和圓柱形靜脈。(ii)靜脈系統(tǒng)的前視圖,包括門靜脈和肝靜脈。(iii)HEAL的無靜脈打印層的俯視圖。比例尺,20毫米。(E) OPEN中HEAL打印的示意圖。PMHs和C166分化為成熟的肝球狀體和匯合的內(nèi)皮細胞。

二、方法
2.1 嵌入網(wǎng)絡、洗滌劑和油墨制備
為了產(chǎn)生OPEN,將12.5 wt% Pluronic® F-127(PF127,Sigma-Aldrich)在4 °C下溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中過夜,直至完全溶解。將2.5 wt%疏水改性羥丙基甲基纖維素(H-HPMC)(Sangelose 90L,Daido Chemical Co.)逐漸加入液體PF127中,并在冰浴中劇烈攪拌。將混合物移到50 mL錐形管中,并以大約1000 rpm 的速度離心1分鐘以去除氣泡;旌衔锉恍⌒牡剞D(zhuǎn)移到丙烯酸盒中作為打印室。將 α-環(huán)糊精(a-CD)粉末在PBS中劇烈攪拌下溶解,作為配對的聚合物去除材料。對于OPEN中的生物打印,在混合或進一步使用之前,通過0.22 μm過濾器對12.5 wt% PF127溶液和5 wt% a-CD溶液進行滅菌。2.5 wt% H-HPMC 粉末和丙烯酸盒在紫外線(UV)下照射過夜。向凍干的GelMA聚合物(SunP Gel G1,SunP Biotech Co.)中加入無菌鹽水制備12.5 wt% GelMA,并將其置于70 °C水浴中直至完全溶解。液化的GelMA通過0.22 μm過濾器進行滅菌,然后分裝到Eppendorf 管中,在4 °C下儲存。

2.2 流變測量
OPEN 的流變學特性是在旋轉(zhuǎn)流變儀(Discovery HR-2、TA儀器)上使用50 μm間隙和直徑為40 mm的平行板獲得的。將樣品轉(zhuǎn)移到測試板上,以2 °C/min的速度從0 °C加熱到40 °C進行溫度掃描,以研究存儲和損耗模量行為隨溫度的變化。進行穩(wěn)態(tài)剪切速率掃描,以測量聚合物網(wǎng)絡在0.01至1000 s−1不同剪切速率下的粘度和屈服應力。為了測量自愈能力,進行了階梯應變測量。對樣品施加高應變量(200%)30秒,然后 30 °C 下反復施加低應變量(1%)相同的時間。通過添加 a-CD 添加劑后粘度下降來評估清洗劑的去除能力,隨后進行穩(wěn)定的剪切速率掃描,掃描范圍0.1至1000 s−1。

三、結(jié)果
3.1 全向打印嵌入式網(wǎng)絡(OPEN)的設計和制造
現(xiàn)有的支持介質(zhì)有兩種類型:顆粒狀凝膠介質(zhì)或散裝凝膠介質(zhì)。前者的典型例子是明膠顆;駽arbopol,它們受到制造復雜性、工作溫度窗口和離子敏感性的限制。散裝凝膠培養(yǎng)基雖然易于制備,但由于難以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的粘度而難以去除,而這是從構(gòu)建體中成功去除支持介質(zhì)所必需的。為了將散裝凝膠培養(yǎng)基的易打印性和顆粒狀凝膠培養(yǎng)基的易去除性相結(jié)合,設計了一種基于疏水相互作用的支持培養(yǎng)基。這種OPEN 是通過在一步混合過程中將兩種FDA批準的市售材料組合而成的。使用的材料是H-HPMC和PF127(圖2A-i)。單獨的Pluronic二嵌段共聚物不能作為自由形式書寫的支撐材料,因為 PF127膠束糾纏網(wǎng)絡是一種不可恢復的水凝膠,在噴嘴移動后會導致裂縫形成。此外,由于 PF127在非纏結(jié)膠束或單聚體狀態(tài)下以液體為主的特性,打印到PF127懸浮液中的結(jié)構(gòu)會下垂。為了克服單獨使用PF127的局限性,假設PF127非纏結(jié)膠束懸浮液可以與疏水性聚合物一起形成一個支撐和可恢復的網(wǎng)絡,用于通過物理交聯(lián)進行全向3D打印。為了驗證這一假設,選擇了具有生物相容性H-HPMC,因為在低H-HPMC濃度下,高密度的疏水部分促進了PF127膠束的疏水核心與H-HPMC羥丙基末端的疏水硬脂基之間的物理相互作用(圖2A-ii)。在優(yōu)化了H-HPMC和PF127的成分比例后,確定了a-CD(也獲得了FDA批準)可作為一種有效的去除劑。a-CD應用于OPEN聚合物網(wǎng)絡,通過a-CD(主體)的疏水內(nèi)腔和H-HPMC(客體)的疏水硬脂;g的客體-宿主相互作用,迅速降低網(wǎng)絡粘度。單獨的a-CD結(jié)構(gòu)類似于一個空心錐體,內(nèi)部疏水,外部親水。當H-HPMC存在時,大多數(shù)側(cè)鏈被a-CD的疏水內(nèi)表面包裹,形成輪烷絡合物。這種復合物破壞了H-HPMC側(cè)鏈之間的疏水相互作用,從而破壞了整個OPEN凝膠,導致OPEN的粘度降低(圖2A-iii)。


圖 2. 通過流變學、形態(tài)學和相容性評估對OPEN形成和液化進行系統(tǒng)表征。(A) OPEN形成和稀疏機制示意圖。(i) 單體PF127和H-HPMC在低于臨界膠束化溫度的溫度下均勻混合形成液相混合物。(ii)混合物被加熱以形成用于包埋印刷的疏水伴生網(wǎng)絡。(iii)打印后,利用α-CD改變網(wǎng)絡的疏水性,導致聚合物網(wǎng)絡液化。(B)含有12.5 % PF127和不同濃度H-HPMC的混合物的溫度掃描,表明H-HPMC給出的溫度依賴性溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。(C)通過添加1.5或2.5 %  H-HPMC來實現(xiàn)打印所需的屈服應力(<100 Pa)。(D)階躍應變測量證明了聚合物網(wǎng)絡的自修復特性。(E) OPEN的SEM圖像顯示其多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),平均孔徑小于20 μm。比例尺,100 μm。(F) OPEN的TEM圖像顯示H-HPMC微原纖維與隨機分布的PF127膠束相關(guān)。比例尺,(i) 100 nm和(ii) 500 nm。(G)通過在24小時內(nèi)細胞-材料直接接觸的活力測定來評估OPEN的生物相容性。對于生物重復,在6 h n ≥ 6小時內(nèi)觀察到高細胞存活率。(H) (i) 通過添加3-5 wt% α-CD可以顯著降低 OPEN粘度。(ii) 5 wt% 的α-CD同樣降低了H-HPMC的粘度,證實H-HPMC在擬議的客體-宿主反應中起著至關(guān)重要的作用。(I)液化OPEN的SEM 圖像,顯示多孔聚合物網(wǎng)絡的破裂結(jié)構(gòu)。比例尺,100 μm。

通過調(diào)整Pluronic和H-HPMC的重量百分比優(yōu)化OPEN的流變特性,以最大限度地提高其支撐能力。考慮到H-HPMC本身的溶解度極限約為3 wt%,對OPEN凝膠進行溫度掃描,從15 wt% Pluronic開始,這是失去非纏結(jié)膠束結(jié)構(gòu)之前的最大濃度,以及2.5 wt% H-HPMC;12.5 wt% Pluronic的OPEN 凝膠在從室溫到體溫的所需溫度窗口內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定的固體特性和可調(diào)模量,適用于生物打印(圖2B)。其他組合物,如5 wt%和10 wt% Pluronic,顯示出以流體為主的特性,而15 wt% Pluronic 表現(xiàn)出低模量可調(diào)性。接下來,通過測量凝膠屈服應力和可恢復性來表征基于12.5 wt% Pluronic的OPEN凝膠中的網(wǎng)絡形成。隨著 H-HPMC 濃度的增加(即更多的疏水部分),觀察到更高的屈服應力和粘度,證實了網(wǎng)絡內(nèi)更強的疏水結(jié)合。1.5 wt%和2.5 wt% H-HPMC 凝膠在100 Pa下均顯示出屈服應力值(圖2C)。為了研究OPEN凝膠的自愈性,應用高應變幅度(200%)來破壞網(wǎng)絡形成,然后立即恢復1%的應變(圖2D)。這兩種凝膠濃度在幾秒鐘內(nèi)表現(xiàn)出相似的自恢復特性。然而,具有較高H-HPMC比率的網(wǎng)絡在破壞和重組循環(huán)中表現(xiàn)出更好的儲能模量恢復。因此,根據(jù)其打印溫度窗口、支撐能力和自我恢復能力,確定12.5 wt% Pluronic 加2.5 wt% H-HPMC是OPEN制備的最佳組合物。有著支撐穩(wěn)定性、印刷精度和與各種交聯(lián)策略的兼容性。
在本文中,旨在探索凝膠網(wǎng)絡的內(nèi)部形態(tài),以闡述其支持機制。為了探索與網(wǎng)絡形成相關(guān)的疏水相互作用,檢查了OPEN的微觀結(jié)構(gòu)。SEM圖像顯示,OPEN凝膠自組裝成平均直徑小于20 μm的孔幾乎均勻分布的結(jié)構(gòu)(圖2E )。然而,用低濃度Pluronic或H-HPMC制備的OPEN 凝膠無法組裝多孔網(wǎng)絡并表現(xiàn)出無定形形態(tài)。在12 wt% 基于Pluronic的 OPEN中,將H-HPMC的濃度略微降低至1.5 wt%,將產(chǎn)生孔徑的異質(zhì)分布,與最佳 OPEN 組成相比,這導致較低的屈服應力和恢復能力。ESEM 還證實,在其水合狀態(tài)下的大多數(shù)網(wǎng)絡孔徑小于20 m。H-HPMC纖維的高度互連性質(zhì)也得到了可視化。為了了解OPEN的形成和自愈機制,還通過TEM研究了H-HPMC纖維的多級分子結(jié)構(gòu)。H-HPMC微原纖維在納米尺度上表現(xiàn)出柔韌和高縱橫比的細絲。PF127膠束的微觀結(jié)構(gòu)在文獻中已經(jīng)得到了很好的研究,它們是直徑約為20 nm的高度均勻的球體。作為PF127球形膠束和H-HPMC原纖維聚合物的水凝膠混合物,假設PF127膠束的疏水片段與H-HPMC微原纖維的疏水側(cè)鏈之間的非共價相互作用調(diào)節(jié)了自組裝和剪切稀化性能。膠束和原纖維之間的典型相互作用在 TEM圖像中顯示,H-HPMC微原纖維組裝在隨機分布的PF127膠束上(圖2F)。在打印過程中,由于噴嘴引起的剪切應力超過了OPEN的屈服應力,因此噴嘴切斷了多孔OPEN凝膠。同時,生物墨水沉積在裂縫中。由于PF127膠束與H-HPMC的硬脂基之間的瞬態(tài)和可逆相互作用,剪切應力去除后發(fā)生了快速的自愈過程。此外,由于OPEN專為生物打印而設計,通過細胞接種評估了OPEN的生物相容性。細胞保持活力(>97%)至少6小時,這比打印過程要長(圖2G )。
此外,3-5 wt% a-CD添加劑的有效減薄行為(圖 2H 和 i),表明一旦打印完成,OPEN就很容易去除。溶劑的過度稀釋通常用作其他支持介質(zhì)的常見去除方法,但不能有效降低OPEN的粘度。當存在a-CD時,OPEN構(gòu)建體的粘度急劇下降,而不是添加更多溶劑時,這表明OPEN去除是特異性的、可控的,并且只能通過H-HPMC和a-CD之間的疏水反轉(zhuǎn)發(fā)生(圖2H 和ii)。驗證了a-CD破壞多孔OPEN凝膠的能力,從而通過對洗滌后分解的網(wǎng)絡和剩余的部分孔結(jié)構(gòu)進行成像來導致OPEN變薄(圖 2I)。

3.2. HEAL 的設計和打印
要使用OPEN建立器官或組織打印的通用打印方案,必須首先確定兼容的生物墨水。GelMA是一種廣泛采用的可光交聯(lián)膠原蛋白樣細胞外基質(zhì)蛋白,常用于生物打印。光交聯(lián)生物墨水特別有用,因為它不需要特定的交聯(lián)條件,也不需要生物墨水中存在額外的交聯(lián)劑。使用GelMA和OPEN,我們確定了打印具有靜脈結(jié)構(gòu)的功能器官的最佳方法。由于需要肝移植替代方案,針對3D打印的HEAL進行了優(yōu)化。使用GelMA/OPEN具有額外肝臟結(jié)構(gòu)的肝臟生物打印也被認為極大地促進了生物工程移植的潛在應用。為了設計導致肝臟結(jié)構(gòu)的打印路徑,采用了Couinaud的人類肝臟節(jié)段解剖結(jié)構(gòu)作為肝靜脈設計的指導,包括肝靜脈和主門靜脈。由于在沒有灌注脈管系統(tǒng)的情況下體積限制和傳質(zhì)受限,在傳統(tǒng)打印中,厚組織或器官重建具有挑戰(zhàn)性。為了利用嵌入式打印提供的設計自由度,為肝臟分配了一個晶格打印通路,為脈管系統(tǒng)分配了一個循環(huán)打印通路。空間位格設計通過為每個單層交替沉積水平和垂直細絲來優(yōu)化氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸。空間晶格設計還確保了打印件內(nèi)的等效細絲到細絲距離,由于重力限制,這在傳統(tǒng)打印中是不可能的。還可以控制打印參數(shù),例如網(wǎng)格布局、網(wǎng)格密度和股線寬度,以為每個組織定制最終結(jié)構(gòu)。結(jié)合載有內(nèi)皮細胞的腎小管靜脈構(gòu)建體,打印了一個帶有主要靜脈系統(tǒng)的人工肝臟模型,用于進一步的生物醫(yī)學評估。
3.3. HEAL 構(gòu)建體中小鼠肝細胞的生物相容性和活性
為了促進HEAL構(gòu)建體內(nèi)細胞的肝功能,用特定的培養(yǎng)基培養(yǎng)打印的PMH,以便組裝成肝球體(圖3A)。首先在體外培養(yǎng)HEAL 21天,以研究PMH的活力。在體外觀察到10天后的高活力(>90%)和相對較高的活力(>80%) 2天(圖3B)。為了確定打印構(gòu)建體中的細胞活性,使用免疫熒光染色分析了肝球形態(tài)和肝標志物蛋白表達。肝原纖維菌在培養(yǎng)10天后表現(xiàn)出較高的ALB和AA 熒光(圖3C和D),表明肝功能。封裝的PMH在整個HEAL打印中自組織成球狀結(jié)構(gòu),并獲得功能性肝細胞的特征多邊形形狀。肝球體還表達以下肝臟代謝標志物蛋白,無需進一步誘導:GST、MRP2和CYP 酶。


圖3. 封裝肝球體的體外表征。(A) PMH 在體外自組織成肝球體。(B)打印的PMH的活/死測定表明,在培養(yǎng)21天內(nèi)具有良好的存活率(>80%)。n≥6用于生物學重復。(C)成熟肝球體的共聚焦(z堆棧,左)和平面(右)圖像。比例尺= 100 μm。(D) GelMA生物墨水中肝球體的共聚焦z堆棧圖像。左和中:AAT(綠色)、ALB(紅色)和DAPI(藍色)。右:GST(紅色)、F-肌動蛋白(綠色)和DAPI(藍色)。比例尺= 20 μm。(E) PAS 染色顯示的糖原儲存。比例尺,200 μm。(F)通過Dil-ac-LDL 熒光染色測定的低密度脂蛋白攝取。比例尺,100 μm。(G) 6小時內(nèi)ICG攝取和釋放。比例尺= 100 μm。(H) 在10天的培養(yǎng)過程中通過qPCR 分析檢測到的肝臟標志基因的表達。數(shù)據(jù)以SD±平均值表示。使用單因素方差分析確定統(tǒng)計顯著性。*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.01,****P < 0.005,;n = 3個生物學重復。(I) 12個樣品的主成分分析。每個點代表一個單獨的樣本。K-means聚類由點的顏色(k = 4)表示。(J) 熱圖顯示了PMH (n = 3)、HEAL (n = 3)、2D (n = 3) 和 3D (n = 3)中肝臟發(fā)育/肝臟形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因表達的分層聚類。

在功能上,肝球體表現(xiàn)出成熟肝細胞的標志性能力。細胞將Dil-ac-LDL導入細胞質(zhì)中,并通過PAS染色呈陽性,證明糖原儲存能力(圖3E和F)。此外,ICG攝取和釋放試驗揭示了細胞的功能狀態(tài)(圖 3G)。此外,10 日齡HEAL中存在中間層,表明移植前有功能性蛋白質(zhì)分泌。為了進一步支持 HEAL 中的肝球表現(xiàn)出肝功能的觀點,除了分析形態(tài)和功能活性外,還使用qRT-PCR訪問了基本的肝臟特異性基因表達。假設HEAL中的PMH受益于空間晶格設計,因為由于確保均勻的絲到絲距離,氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)可以自由擴散到整個結(jié)構(gòu)中。為此,分析了兩組PMHs:(1) 2D培養(yǎng)中的PMHs和(2)在散裝或HEAL基質(zhì)中3D培養(yǎng)的PMHs。利用新鮮分離的PMHs的基因表達模式作為功能性肝細胞基因表達的對照組。對于在HEAL中培養(yǎng)10天的細胞,必需肝細胞特異性基因(如Alb和Aat)的表達水平是新鮮分離的PMHs的40 %。其他肝臟標志物基因,包括鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Fpn)、細胞角蛋白8 (Krt8)和細胞角蛋白18 (Krt18),在HEAL構(gòu)建體中的表達水平顯著高于2D、大量3D甚至PMHs對照組。細胞色素P450、家族2、亞家族e、多肽1(Cyp2e1)和細胞色素P450、家族3、亞家族a、多肽11 (Cyp3a11,人CYP3A4等效物)表達也觀察到類似的結(jié)果,表明細胞色素P450代謝在HEAL構(gòu)建體中?偟膩碚f,這些結(jié)果表明,與2D和3D大量培養(yǎng)條件相比,HEAL中的肝球表現(xiàn)出更好的肝功能(圖3H)。為了系統(tǒng)評估HEAL中肝球體的基因表達譜,并詢問HEAL與2D、3D培養(yǎng)物之間的差異,進行了大量mRNA測序。圖3J顯示了83個肝功能相關(guān)基因 (肝臟發(fā)育/GO:0001889 和肝臟形態(tài)發(fā)生/GO:0072576)的熱圖。HEAL的肝臟基因表達模式與新鮮分離的PMH 非常相似(圖3I和J)。值得注意的是,關(guān)鍵肝細胞轉(zhuǎn)錄因子(如Jun、Cebpa、Cited2、Runx1和Otc)在新鮮分離的PMHs和HEAL中均高表達,但在2D或3D培養(yǎng)的PMHs中則不高。此外,對PMHs、HEAL和2D組進行了差異基因分析,并從分析中生成了6個具有相似表達模式的簇。有趣的是,DEGs的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析揭示了多個肝臟和核糖體基因,這些基因在2D中下調(diào),但在HEAL條件下恢復到正常水平?傊,這些發(fā)現(xiàn)表明,轉(zhuǎn)化控制和非酒精性脂肪肝病 (NAFLD) 相關(guān)途徑可能允許HEAL中的肝球維持肝功能。

3.4. 體內(nèi)HEAL構(gòu)建體的新生血管化
由于通過HEAL構(gòu)建體的體外微型肝臟重建表現(xiàn)出肝臟結(jié)構(gòu)和功能,接下來評估了體內(nèi)構(gòu)建體的性能,以更好地了解其肝移植的潛力。將HEAL在體外培養(yǎng)2周,移植到小鼠體內(nèi),并在體內(nèi)再放置2周(圖4A)。內(nèi)源性新生血管形成對于體內(nèi)肝細胞球體的維持至關(guān)重要,因為脈管系統(tǒng)是氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)輸送所必需的,因此細胞功能和存活也是必要的。假設,與傳統(tǒng)打印相比,晶格設計中層和鏈之間保留的間隙可能有助于體內(nèi)血管生成。然而,單獨HEAL中的血管生成與傳統(tǒng)3D打印肝臟構(gòu)建體中的血管生成沒有顯著差異。為了解決這個問題,修改了HEAL打印設計,包括肝靜脈和門靜脈,并將C166細胞作為細胞構(gòu)建塊摻入靜脈打印中(圖4B)。將血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)應用于載有C166的生物墨水上,以促進內(nèi)皮細胞增殖。


圖4. 有或沒有靜脈結(jié)構(gòu)的HEAL移植的體內(nèi)新生血管形成。(A)通過載有肝球鏈之間的保留間隙的內(nèi)源性新生血管形成示意圖。(B)移植14天后血管化HEAL的明場圖像,顯示打印的晶格結(jié)構(gòu)自由空間上的血管生成。比例尺,20毫米。(C)通過尾靜脈注射輸注熒光葡聚糖,顯示移植內(nèi)功能性新血管。比例尺,200 μm。(D) AAT 陽性移植部位上新血管的熒光圖像,顯示從宿主到打印的HEAL移植物的血管化。(i)無靜脈的HEAL新生血管化。(ii) HEAL與靜脈的新生血管化。比例尺,500 μm。(E)分別定量有或沒有靜脈的HEAL 的血管密度和總血管長度。(i)與單獨的HEAL打印相比,帶有靜脈的HEAL的平均血管密度增加了10 %。(ii) 與單獨使用HEAL打印相比,帶有靜脈的HEAL的總血管長度增加了約1.6倍。數(shù)據(jù)以SD ±平均值表示。使用未配對的雙尾t檢驗確定統(tǒng)計顯著性。*P < 0.05,***P < 0.01;n = 6個生物學重復。(F-G)肝臟標志物(ALB和AAT)陽性移植成分頂部的新血管的共聚焦(z堆棧,左)和平面(右)圖像。ALB或AAT(紅色)、Neovessels(綠色)和DAPI(藍色)。比例尺= 200 μm。(H)血管標志物CD31陽性移植成分頂部的新血管的共聚焦(z堆棧,左)和平面(右)圖像。CD31(紅色)、新血管(綠色)和 DAPI(藍色)。比例尺= 200 μm。(I) 移植玻片的CD31和ALB免疫組織化學染色,證實移植 HEAL 內(nèi)維持的肝功能和顯著的新生血管形成。

完全實現(xiàn)的HEAL顯示平均新血管密度增加10 %,總血管長度增加60 %,表明血管生成增強(圖4C、D、4E)。這種改善可能是由于打印的內(nèi)皮細胞和打印靜脈內(nèi)的VEGF的引入。雖然單獨的空間晶格設計不足以增強新生血管形成,但充滿內(nèi)皮細胞的靜脈和空間晶格設計的結(jié)合可能會協(xié)同作用,促進體內(nèi)血管生成。具有陽性ALB、AAT染色以及熒光標記血管網(wǎng)絡的顯微鏡圖像的疊加為功能性肝細胞和新血管共存提供了證據(jù),表明該綜合方法有效地支持3D打印HEAL內(nèi)的肝細胞功能和血管生長(圖4F和G)。
值得注意的是,在打印靜脈的外表面觀察到內(nèi)源性新生血管形成。同時,打印的靜脈顯示出包埋細胞的襯里,表明包埋的內(nèi)皮細胞已經(jīng)形成了匯合層(圖4H)。這一觀察結(jié)果表明,鑒于打印的靜脈位于 HEAL 構(gòu)建體的中心,新血管廣泛滲透到移植的HEAL印記的內(nèi)部。由于打印的載有內(nèi)皮細胞的靜脈在移植后充當血管生成的病灶,因此新血管能夠逐漸浸潤移植的HEAL內(nèi)部,從而增強對植入組織的營養(yǎng)和氧氣輸送。這種整合過程最終支持了植入物的功能和存活,這是成功移植生物工程組織和器官的關(guān)鍵方面。此外,空間晶格設計的采用,結(jié)合載有內(nèi)皮細胞的靜脈,可能會增強體內(nèi)血管生成,最終導致HEAL構(gòu)建體更有效的性能。利用IHC染色來可視化廣泛的血管形成,陽性CD31染色在體內(nèi)顯示內(nèi)源性血管生成(圖4I)。此外,IHC染色顯示HEEL在移植2周后保持了極好的肝功能(圖4I)。

四、討論
3D生物打印是一種有效的方法,可以創(chuàng)建具有仿生微環(huán)境的模型,這對藥物篩選和組織再生至關(guān)重要。在過去的十年中,使用臨床前模型對生物打印構(gòu)建體進行植入和功能評估的研究顯著增加。然而,由于制造大型空心管狀結(jié)構(gòu)和心臟和腎臟等整個器官的挑戰(zhàn),傳統(tǒng)生物打印產(chǎn)品的臨床轉(zhuǎn)化受到阻礙。這是因為現(xiàn)有的生物打印機無法復制天然微血管系統(tǒng),并且由于引力而容易導致較大的結(jié)構(gòu)塌陷。嵌入式生物打印是一種新興的挑戰(zhàn)解決方案,因為這種新穎的凝膠-凝膠-方法使用機械弱或低粘度的生物墨水,通過減輕引力來生產(chǎn)大型和復雜的3D結(jié)構(gòu)。支撐槽的使用有助于打印多種復雜結(jié)構(gòu),包括骨骼和心臟,并增強形狀保真度。
肝臟是與人體至關(guān)重要而錯綜復雜的器官,具有合成和分泌、藥物代謝、血液凝固和免疫等多重功能。雖然肝移植是終末期肝病的實用解決方案,但其療效受到供體稀缺和免疫排斥的限制。肝組織再生工程已成為一種有前途的肝臟供體替代策略。先前的肝臟生物打印研究主要依賴于基于擠壓3D生物打印技術(shù),使用明膠或藻酸鹽作為生物墨水,并生產(chǎn)出尺寸較小的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu),通常為1cm×1cm,厚度為4層。使用脈管系統(tǒng)實現(xiàn)大型器官水平肝臟生物打印仍然難以捉摸。鑒于這一限制,建議探索使用創(chuàng)新支持培養(yǎng)基OPEN打印具有靜脈結(jié)構(gòu)的微型肝臟并評估其肝功能和血管生成潛力的可行性。
首先定制了基于OPEN和GelMA組合的生物制造方案,GelMA是一種一次性形成的細胞外基質(zhì)(圖1B和C)。根據(jù)節(jié)段性肝臟解剖結(jié)構(gòu)設計打印路徑,并使用嵌入GelMA墨水中的活細胞打印這些結(jié)構(gòu)(圖1D)。代表性的PMH和C166細胞被用作封裝的細胞構(gòu)建塊,在體外重建具有靜脈結(jié)構(gòu)的生物功能HEAL(圖1E)。在HEAL中,PMH在體外自組織成肝細胞球體,表達多種肝臟標志物,與傳統(tǒng)的2D或3D批量培養(yǎng)條件相比,肝功能和肝基因表達得到改善(圖3)。然后,將生物活性HEAL移植到小鼠體內(nèi),并在體內(nèi)放置兩周(圖 2A)。肝球狀體包封的移植促進了體內(nèi)成熟肝球狀體的內(nèi)源性新生血管形成并維持了成熟肝球狀體的標志物蛋白表達(圖2B-H)。與沒有靜脈和常規(guī)網(wǎng)格打印的 HEAL 相比,帶有內(nèi)皮細胞的靜脈的 HEAL 移植促進了體內(nèi)新生血管形成(圖2E)。因此有效地證明,OPEN 作為一種新型支持培養(yǎng)基,能夠嵌入具有靜脈結(jié)構(gòu)的3D-HEAL生物打印,在體外表現(xiàn)出令人滿意的肝功能,在移植后體內(nèi)表現(xiàn)出血管生成潛力。
盡管在3D 嵌入式生物打印構(gòu)建肝組織方面取得了研究成果,但仍然敏銳地意識到具有靜脈結(jié)構(gòu)的HEAL的結(jié)構(gòu)和功能與真正的肝臟還相去甚遠。肝臟的復雜性包括一個高度復雜的解剖框架和多種生理功能,肝小葉是組成部分。這些小葉由門靜脈三聯(lián)征、肝細胞在毛細血管網(wǎng)絡和中央靜脈之間呈線性線狀排列。除了肝細胞外,肝臟還隱藏著一個錯綜復雜的導管網(wǎng)絡,包括Glisson系統(tǒng)、肝靜脈系統(tǒng)和膽道系統(tǒng)。因此,雖然復制功能良好的肝球體和靜脈結(jié)構(gòu)勢在必行,但復制動脈結(jié)構(gòu)和膽管同樣重要但具有挑戰(zhàn)性。在探索肝細胞和內(nèi)皮細胞之間的相互作用方面也有局限性,包括體內(nèi)和體外。沒有徹底研究生物材料特性和細胞空間排列的修改如何影響這些相互作用。此外,在細胞水平上,除了肝細胞和內(nèi)皮細胞之外,膽管細胞、星狀細胞和各種免疫細胞(如Kupffer)對于實現(xiàn)肝臟的全部功能是必不可少的。預計多細胞肝臟生物打印將取得進一步進展,從而更好地模擬肝臟微結(jié)構(gòu)和功能。這一目標的實現(xiàn)取決于生物打印技術(shù)的進一步改進,包括多噴嘴聯(lián)動打印,以及能夠支持多種細胞類型生長和相互作用的生物墨水和多細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的持續(xù)開發(fā)。

五、結(jié)論
開發(fā)了一種稱為 OPEN 的大塊凝膠支持介質(zhì),將該介質(zhì)與兼容的生物墨水相結(jié)合,并創(chuàng)建了 HEAL 結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可在體外保留肝功能并在體內(nèi)促進新血管形成。簡便的制備、簡單的去除方法以及將 OPEN 與不同的生物墨水和交聯(lián)方法輕松結(jié)合的便利性使 OPEN 成為組織或器官 3D 生物打印的有用工具。隨著人類細胞重編程和分化的不斷進步,平臺提供了一種現(xiàn)成的途徑來設計具有多種細胞類型的打印結(jié)構(gòu),以重現(xiàn)具有高度結(jié)構(gòu)和功能相似性的目標組織或器官。設想OPEN將為個性化再生醫(yī)學鋪平道路,有朝一日可以作為器官功能替代手術(shù)中使用的可移植替代品。

六、參考文獻
Zhuoran Jiang, Bao Jin, Zhu Liang, Yinhan Wang, Shuai Ren, Yongfa Huang, Changcan Li, Hang Sun, Yunzhu Li, Li Liu, Nianlin Li, Jinzhuo Wang, Zhanfeng Cui, Pengyu Huang, Huayu Yang, Yilei Mao, Hua Ye,Liver bioprinting within a novel support medium with functionalized spheroids, hepatic vein structures, and enhanced post-transplantation vascularization,
Biomaterials,Volume 311,2024,122681,ISSN 0142-9612,
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122681.




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