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半月板復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能以及有限血供使其再生修復(fù)依然充滿挑戰(zhàn)。近日，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京積水潭醫(yī)院矯形骨科陳明學(xué)醫(yī)生基于低溫沉積3D打印技術(shù)構(gòu)建新型組織工程半月板支架，評(píng)價(jià)該支架理化性質(zhì)及生物相容性。該文章名為“Construction of a novel tissue engineered meniscus scaffold based on low temperature deposition three-dimenisonal printing technology”，發(fā)表在Chinese Journal of Reconstructive and Reconstructive Surgery上。本研究基于低溫沉積3D打印技術(shù)構(gòu)建新型組織工程半月板支架，評(píng)價(jià)該支架理化性質(zhì)及生物相容性。結(jié)果表明，脫細(xì)胞處理后半月板基質(zhì)勻漿呈透明凝膠狀，DAPI和組織學(xué)染色示免疫原性的核酸去除，同時(shí)黏多糖及膠原成分保留。采用低溫沉積3D打印技術(shù)成功構(gòu)建新型組織工程半月板支架，掃描電鏡示支架呈分級(jí)大孔-微孔的微觀結(jié)構(gòu)；CCK-8檢測(cè)示支架具有良好細(xì)胞相容性；死/活細(xì)胞染色示支架可有效維持細(xì)胞活性(>90%)；細(xì)胞骨架染色示支架有利于細(xì)胞黏附和鋪展；支架植入大鼠皮下1周后有輕度炎癥反應(yīng)，3周后未見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)，并可見(jiàn)支架逐步降解�；�于低溫沉積3D打印技術(shù)構(gòu)建的新型組織工程半月板支架具有分級(jí)大孔-微孔的微觀結(jié)構(gòu)和良好細(xì)胞相容性，有利于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)，為下一步體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

背景介紹

半月板損傷的再生修復(fù)目前依然充滿挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著再生醫(yī)學(xué)和組織工程技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建組織工程半月板支架實(shí)現(xiàn)半月板損傷的再生修復(fù)逐漸得到認(rèn)可。理想的半月板組織工程支架應(yīng)模擬天然半月板空間結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，有良好細(xì)胞相容性，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，促進(jìn)損傷半月板的再生和修復(fù)。脫細(xì)胞基質(zhì)由于具有仿生成分和天然微結(jié)構(gòu)，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用。其最大優(yōu)點(diǎn)在于良好生物相容性，可很好地模擬細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，有效促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞半月板基質(zhì)可有效促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)損傷半月板再生修復(fù)，可以作為理想的生物材料。

3D打印技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高度個(gè)性化制造，準(zhǔn)確制造出具備復(fù)雜結(jié)構(gòu)的支架。然而，傳統(tǒng)熔融沉積3D打印技術(shù)因打印過(guò)程中需要加熱融化材料，故無(wú)法用于脫細(xì)胞半月板基質(zhì)打印。 近年，低溫沉積3D打印技術(shù)的出現(xiàn)為打印該材料提供了可能。該打印技術(shù)是在超低溫(−30~ −20℃)平臺(tái)上逐層搭建支架，經(jīng)冷凍干燥和相分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)支架高度連通的大孔-微孔結(jié)構(gòu)。相對(duì)于傳統(tǒng)熔融沉積3D打印技術(shù)，其具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)超低溫下完成打印，可以有效保護(hù)材料生物活性;(2)能構(gòu)建具有高度連通的大孔-微孔結(jié)構(gòu)，提高了支架孔隙率，這種分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)為細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換和擴(kuò)散提供了通道。

本研究以脫細(xì)胞半月板基質(zhì)為原料，[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]通過(guò)低溫沉積3D打印技術(shù)(SUNP BIOMAKER 生物打印機(jī)【上普博源（北京）生物科技有限公司】)構(gòu)建新型組織工程半月板支架，評(píng)價(jià)該支架理化特性和生物相容性，為其用于體內(nèi)修復(fù)損傷半月板組織奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法

取新鮮豬膝關(guān)節(jié)半月板，采用改良物理化學(xué)聯(lián)合方法脫細(xì)胞處理，獲得脫細(xì)胞半月板基質(zhì)勻漿；經(jīng)大體觀察、HE及DAPI染色觀察脫細(xì)胞效果，甲苯胺藍(lán)、番紅O及天狼猩紅染色評(píng)估黏多糖和膠原保留情況。然后制備脫細(xì)胞半月板基質(zhì)生物墨水，通過(guò)低溫沉積3D打印技術(shù)制備新型組織工程半月板支架。掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)；與脂肪來(lái)源干細(xì)胞共培養(yǎng)后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）檢測(cè)支架細(xì)胞相容性，死/活細(xì)胞染色和細(xì)胞骨架染色觀察細(xì)胞活性和形態(tài)；植入大鼠皮下后組織學(xué)染色評(píng)估支架炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與降解情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大體觀察半月板組織呈半月形或C形，脫細(xì)胞前呈乳白色纖維軟骨樣組織，質(zhì)地柔軟、有彈性；脫細(xì)胞半月板基質(zhì)呈透明凝膠狀。DAPI及HE染色示，脫細(xì)胞前半月板有大量細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，脫細(xì)胞處理后半月板基質(zhì)未見(jiàn)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，表明具有免疫原性的核酸組織徹底去除。番紅O、甲苯胺藍(lán)及天狼猩紅染色示，脫細(xì)胞前后均呈陽(yáng)性，提示脫細(xì)胞過(guò)程中黏多糖和膠原成分保留。

圖1.半月板觀察   左側(cè)示脫細(xì)胞前，右側(cè)示脫細(xì)胞后

a.大體觀察；b. DAPI染色熒光顯微鏡觀察；c. HE染色；d.番紅O染色；e.甲苯胺藍(lán)染色；f.天狼猩紅染色

大體觀察見(jiàn)新型組織工程半月板支架呈交叉網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，纖維排列整齊。掃描電鏡下可見(jiàn)支架具有明顯縱橫交錯(cuò)結(jié)構(gòu)，大孔徑(直徑200~300 μm)分布較均勻，纖維徑上微孔相互連接，微孔直徑10~30 μm。(圖2a,b)

圖2. 新型組織工程半月板支架觀察

a.大體觀察；b.掃描電鏡觀察；c. CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖；

d.激光共聚焦顯微鏡下培養(yǎng)1天(上)及7天(下)死/活細(xì)胞染色觀察 從左至右分別為活細(xì)胞染色、死細(xì)胞染色及兩者重疊；

e.激光共聚焦顯微鏡觀察培養(yǎng) 7天鬼筆環(huán)肽染色觀察；f、g.大鼠皮下植入后1、3周HE染色觀察。

CCK-8檢測(cè)示兩組A值均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，其中培養(yǎng)3、5天時(shí)實(shí)驗(yàn)組A值大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2c)。死/活細(xì)胞染色示，支架上細(xì)胞以活細(xì)胞為主，細(xì)胞活性達(dá)90 %以上(其中1天94 %、7天95 %)(圖2d)。鬼筆環(huán)肽染色示培養(yǎng)7天后支架上細(xì)胞呈梭形、分布均勻(圖2e)。支架埋植于大鼠背部皮下HE染色示，1周時(shí)支架內(nèi)部和支架與組織交界處炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支架無(wú)明顯降解；3周時(shí)未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支架有部分降解，支架體積和纖維直徑較植入前減小。

實(shí)驗(yàn)討論

近年來(lái)，隨著半月板組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，體外、內(nèi)半月板替代物研發(fā)取得了許多進(jìn)展。然而，半月板復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能以及有限血供使其再生修復(fù)依然充滿挑戰(zhàn)。半月板再生過(guò)程中，支架應(yīng)具有合適理化特性的結(jié)構(gòu)框架，以幫助宿主細(xì)胞黏附和遷移，同時(shí)良好的仿生結(jié)構(gòu)可以提供一個(gè)良好再生微環(huán)境。3D打印技術(shù)為構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)和異質(zhì)性半月板提供了技術(shù)支撐。本研究采用的低溫沉積3D打印技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的快速成型技術(shù)之一，它不僅基于快速沉積制造工藝，而且結(jié)合了相分離工藝。采用該技術(shù)構(gòu)建的組織工程支架除了具有可控的大孔徑外，在纖維徑上還具有相互連接的微孔，這些微孔有利于細(xì)胞旁分泌，增強(qiáng)細(xì)胞生物學(xué)功能，在組織工程支架制備和復(fù)雜器官設(shè)計(jì)方面具有廣闊應(yīng)用前景。

目前，應(yīng)用于3D生物打印的生物墨水主要分為人工合成材料和天然生物材料。人工合成材料主要有聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乳酸復(fù)合物、聚乳酸等。它們雖然具有物理機(jī)械性能良好、可控性強(qiáng)、微結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，但親水性差、對(duì)細(xì)胞吸附力弱以及生物相容性不理想。天然生物材料包括海藻酸鈉、明膠、膠原蛋白、殼聚糖、纖維蛋白、透明質(zhì)酸和脫細(xì)胞外基質(zhì)。其中脫細(xì)胞外基質(zhì)保留了大部分天然成分，無(wú)免疫原性，是促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的理想生物材料。既往文獻(xiàn)及本團(tuán)隊(duì)研究顯示脫細(xì)胞半月板基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)和各種功能分子能決定干細(xì)胞分化方向，可能進(jìn)一步促進(jìn)半月板再生。因此，本研究中我們選擇開(kāi)發(fā)具有可打印性和滿足細(xì)胞相容性的脫細(xì)胞半月板基質(zhì)生物墨水，并基于低溫沉積3D打印技術(shù)構(gòu)建結(jié)構(gòu)和成分雙仿生的新型組織工程半月板支架。

研究結(jié)果顯示，脫細(xì)胞技術(shù)成功去除半月板組織中具有免疫原性的核酸組織，并很好地保留了基質(zhì)生物活性成分，包括黏多糖和多種膠原蛋白；制備的脫細(xì)胞半月板基質(zhì)具有可打印性，利用低溫沉積3D打印技術(shù)成功構(gòu)建新型組織工程半月板支架。掃描電鏡觀察示這種新型支架不僅具有縱橫交錯(cuò)的纖維，類似天然半月板膠原排列，更重要的是纖維徑上形成了直徑10～30 μm的微孔，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了黏附位點(diǎn)，也為細(xì)胞物質(zhì)交換、廢物排出提供了通道。既往研究也表明支架多孔結(jié)構(gòu)有助于細(xì)胞增殖、分化。本研究CCK-8檢測(cè)示隨著時(shí)間推移，支架上細(xì)胞增殖明顯更快、更多，死/活細(xì)胞染色示支架上細(xì)胞活性良好，只見(jiàn)少量死細(xì)胞，提示構(gòu)建的支架具有良好細(xì)胞相容性。同時(shí)，細(xì)胞骨架染色示MSCs能很好地在支架上黏附和伸展，并保持干細(xì)胞形態(tài)。進(jìn)一步將支架植入大鼠皮下觀察，植入1周有輕度炎癥反應(yīng)，3周炎癥反應(yīng)逐漸減輕，并出現(xiàn)支架部分降解。這種早期炎癥反應(yīng)會(huì)募集巨噬細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)組織再生修復(fù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

理想的半月板組織工程支架應(yīng)模擬天然半月板空間結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，有良好細(xì)胞相容性，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，促進(jìn)損傷半月板的再生和修復(fù)。因此，本研究成功制備脫細(xì)胞半月板基質(zhì)生物墨水，并利用低溫沉積3D打印技術(shù)構(gòu)建一種具有大孔-微孔分級(jí)微觀結(jié)構(gòu)的新型組織工程半月板支架，其能為細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附和增殖提供良好微環(huán)境。未來(lái)需進(jìn)一步探討該支架在體外成軟骨分化作用及體內(nèi)修復(fù)損傷半月板組織的效果，為其用于半月板再生修復(fù)提供更多數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)

Chen Mingxue, Wu Jiang, Yin Han, Wei Xiang, Liu Shuyun, Guo Quanyi.Construction of a novel tissue engineered meniscus scaffold based on low temperature deposition three-dimenisonal printing technology.

Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, 2024, 38(6): 748-754. doi: 10.7507/1002-1892.202402063