高分辨率投影式生物3D打印

來(lái)源： EngineeringForLife

投影式3D打�。≒BP）的核心在于利用空間光調(diào)制器生成動(dòng)態(tài)掩模，并將光學(xué)圖案投影至光敏材料表面，實(shí)現(xiàn)選擇性地精準(zhǔn)固化。該技術(shù)在所有3D打印技術(shù)中具有最高的分辨率/制造時(shí)間比（RTM）。然而，在使用生物墨水作為打印材料的投影式生物3D打�。≒BBP）中，打印分辨率卻不盡如人意，實(shí)際的打印分辨率與理論分辨率之間存在顯著差距。這主要因?yàn)榛罴?xì)胞的引入使得傳統(tǒng)制造策略不再適用，對(duì)生物相容性的嚴(yán)格要求大大限制了打印分辨率。

EFL團(tuán)隊(duì)致力于生物3D打印研究十余年，為全球5000多個(gè)實(shí)驗(yàn)室提供生物3D打印系統(tǒng)解決方案，涵蓋光固化生物墨水和投影式生物3D打印機(jī)。在與眾多同行科學(xué)家交流的過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)背景知識(shí)的差異導(dǎo)致了對(duì)許多基本概念的誤解和混淆。例如：“光學(xué)分辨率”被誤認(rèn)為是“打印分辨率”；許多聲稱“高分辨率生物打印”的研究工作卻展現(xiàn)出幾個(gè)數(shù)量級(jí)的差異；“生物墨水（Bioinks）”的打印分辨率被混同于“生物材料墨水（Biomaterial inks）”的打印分辨率，諸如此類。

由于缺乏公認(rèn)的分辨率定義，在描述新方法時(shí)常會(huì)出現(xiàn)混亂，無(wú)疑阻礙了該領(lǐng)域的發(fā)展。因此，我們認(rèn)為有必要澄清高分辨率PBBP的一些基本概念，以幫助來(lái)自不同背景的科學(xué)家深入理解其核心邏輯。為此，我們系統(tǒng)總結(jié)了實(shí)現(xiàn)高分辨率PBBP的必要步驟和挑戰(zhàn)，并為每個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)梳理了可行的優(yōu)化策略。同時(shí)，我們也分享了一些對(duì)未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)的看法。我們希望為科研人員提供核心知識(shí)支撐，共同推動(dòng)PBBP技術(shù)在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的迅速發(fā)展。相關(guān)工作“High-resolution projection-based 3D bioprinting”發(fā)表于《Nature Reviews Bioengineering》。浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院博士生何超凡為第一作者，賀永教授為通訊作者。   

投影式生物3D打印的“分辨率”：市面上的投影式3D打印機(jī)均會(huì)標(biāo)注一個(gè)標(biāo)稱分辨率數(shù)值（通常為2-50 μm）。此分辨率通常指的是光學(xué)分辨率，即理論上可達(dá)到的最高分辨率，定義為“投影圖案中單個(gè)像素點(diǎn)的尺寸”，具體由DMD微鏡的尺寸與投影鏡頭的放大倍率共同決定。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，我們更為關(guān)注的是打印結(jié)構(gòu)的實(shí)際分辨率，即打印分辨率，定義為“打印結(jié)構(gòu)中可區(qū)分的最小尺寸”。它不僅受打印機(jī)光學(xué)分辨率的影響，還受到打印材料光響應(yīng)特性的制約。因此，即便是同一臺(tái)打印機(jī)，其打印分辨率也可能存在較大差異。光學(xué)分辨率具有明確的定義和測(cè)試方法，而“可辨識(shí)的”最小尺寸則是一個(gè)相對(duì)模糊的概念。因此，測(cè)試打印分辨率的方法也不盡相同�？傮w而言可分為四類：正分辨率（RP）、負(fù)分辨率（RN）、水平分辨率（RXY）以及垂直分辨率（RZ）。盡管它們都被統(tǒng)稱為“打印分辨率”，但實(shí)際上各自具有不同的含義和適用場(chǎng)景。

圖1 投影式3D打印的分辨率

“高分辨率”生物3D打印：高分辨率是一個(gè)相對(duì)且動(dòng)態(tài)的概念，它會(huì)隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步而發(fā)生變化。然而，確立一個(gè)客觀的物理指標(biāo)作為衡量標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。在生物3D打印領(lǐng)域，可以通過(guò)分析理論上可達(dá)到的最高打印分辨率，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)放寬（通常是理論極限的五到十倍），從而設(shè)定一個(gè)高分辨率的標(biāo)準(zhǔn)。考慮到準(zhǔn)確且合理的定義對(duì)于避免歧義、確保研究的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性至關(guān)重要。這里我們定義：對(duì)于使用含有活細(xì)胞的生物墨水，打印分辨率達(dá)到50 μm被定義為高分辨率打印。而對(duì)于生物材料墨水（即打印材料作為后續(xù)細(xì)胞接種的支架），打印分辨率達(dá)到10 μm被定義為高分辨率打印。這也與當(dāng)前許多研究保持一致。   

高分辨率投影式生物3D打印策略：

使用樹(shù)脂的傳統(tǒng)PBP的打印分辨率與光學(xué)分辨率可以非常接近（打印分辨率可達(dá)光學(xué)分辨率的2-3倍），然而使用生物墨水/生物材料墨水的PBBP的打印分辨率卻遠(yuǎn)低于理論值（打印分辨率通常為十幾倍的光學(xué)分辨率）。因此，生物3D打印需要進(jìn)行全面的系統(tǒng)優(yōu)化，而非僅僅局限于對(duì)某一單個(gè)步驟的改進(jìn)。為了推動(dòng)高分辨率PBBP技術(shù)的發(fā)展，我們總結(jié)了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)所需的三大關(guān)鍵步驟，并通過(guò)構(gòu)建優(yōu)化路線圖，為打印分辨率的提升提供全面指導(dǎo)。

構(gòu)建精準(zhǔn)光場(chǎng)
在PBP技術(shù)中，提高打印分辨率的一個(gè)核心在于構(gòu)建可控的投影光場(chǎng)。這一過(guò)程的實(shí)現(xiàn)首先依賴于打印軟件，將設(shè)計(jì)的3D模型精確地切割成一系列二維圖像。隨后，這些圖像通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行投影。該系統(tǒng)通常由光源、均勻透鏡組、數(shù)字微鏡設(shè)備（DMD）以及投影透鏡組成。光源發(fā)出的光線首先經(jīng)過(guò)均勻透鏡組，然后照射到DMD上。DMD中的每個(gè)微鏡根據(jù)預(yù)設(shè)的切片圖像反射光線，經(jīng)過(guò)投影透鏡的縮放作用后，最終形成投影光場(chǎng)。值得注意的是，這一系列步驟中的每一個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)光學(xué)分辨率產(chǎn)生直接影響。無(wú)論是PBBP還是PBP，其打印分辨率的上限都受到光學(xué)分辨率的制約。  

圖2 構(gòu)建精準(zhǔn)光場(chǎng)

墨水精確響應(yīng)

提高打印分辨率的第二步是確保生物墨水能夠準(zhǔn)確地響應(yīng)光場(chǎng)。為此，在保持生物墨水生物性能的同時(shí)，改善其光響應(yīng)特性顯得尤為重要。理想的生物墨水應(yīng)具備高的光交聯(lián)速率、適當(dāng)?shù)慕宦?lián)密度以及良好的流動(dòng)性。同時(shí)，為了確保生物相容性，生物墨水中的化學(xué)添加劑應(yīng)盡可能少。因此，在生物（材料）墨水通常僅包含生物相容性材料、光引發(fā)劑、光吸收劑、生物活性成分以及可能的細(xì)胞組分。   

圖3 墨水精準(zhǔn)響應(yīng)

維持力學(xué)平衡

實(shí)現(xiàn)高分辨率PBBP的最后一步在于保持打印過(guò)程中的力學(xué)平衡。這一步驟至關(guān)重要，因?yàn)樯�物墨水通常為超軟材料（楊氏模量低�?03 Pa）。由于生物墨水與傳統(tǒng)材料之間存在顯著的力學(xué)性能差異，因此，在打印過(guò)程中需要謹(jǐn)慎操作以保持機(jī)械平衡，否則很容易導(dǎo)致打印結(jié)構(gòu)的斷裂和變形，這是PBBP所獨(dú)有的挑戰(zhàn)。   

圖4 維持力學(xué)平衡

賀永教授團(tuán)隊(duì)從事生物制造研究工作數(shù)十年，研究工作涵蓋墨水成形理論、打印工藝、打印設(shè)備以及應(yīng)用。近兩年的代表性工作包括：
（1）揭示了光固化生物墨水的成形機(jī)理，定義了包括平均反應(yīng)步數(shù)等生物墨水成形狀態(tài)的四項(xiàng)精確評(píng)價(jià)指標(biāo)（Advanced Functional Materials, 2023）,制定了光固化生物墨水GelMA的命名規(guī)范及標(biāo)準(zhǔn)（Advanced Healthcare Materials，2023），給出了高精度光固化生物打印所需遵循的準(zhǔn)則（Nature Review Bioengineering, 2024）。與李文妍教授團(tuán)隊(duì)合作揭示了可控機(jī)械應(yīng)力驅(qū)動(dòng)細(xì)胞行為、誘導(dǎo)聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)中的感覺(jué)上皮形成機(jī)制（Science Advances, 2023）。

（2）提出了基于“生物混凝土”概念的原位3D打印方法，能夠在災(zāi)難現(xiàn)場(chǎng)、戰(zhàn)場(chǎng)等極端環(huán)境下實(shí)現(xiàn)快速打印及創(chuàng)傷修復(fù)（Nature Communications，2022）；面向微創(chuàng)手術(shù)下如何有效再生，提出了可收縮支架微創(chuàng)植入新方法，為軟組織修復(fù)提供了新的解決方案（Nature Communications，2024），通過(guò)仿藍(lán)環(huán)章魚結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)新型微針，實(shí)現(xiàn)了潮濕環(huán)境下藥物的有效控釋（Science Advances, 2023）。提出3D打印自吸附干細(xì)胞支架方法，開(kāi)發(fā)了細(xì)胞治療的高效載體工具（Advanced Science，2023）。

（3）在器官體外再造研究中，與陳昶教授團(tuán)隊(duì)合作實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)段活性氣管重建，證明了工程化制造的器官能夠移植并長(zhǎng)期存活（Science Translational Medicine，2023）。

文章來(lái)源：
https://www.nature.com/articles/s44222-024-00218-w