《Bioact. Mater.》：高機械穩(wěn)定性的3D打印生物水凝膠

來源： EFL生物3D打印與生物制造

3D打印允許在微米級別上對結構進行控制，同時精確控制多種細胞類型的位置以創(chuàng)建與原生組織相匹配的復雜結構。生物水凝膠由于其生物相容性、明確的細胞黏附配體以及生物降解性（允許細胞遷移并為大分子和小分子的傳輸提供有利條件），被廣泛用作細胞3D打印的生物墨水。水凝膠具有類似原生組織的粘彈性，通常具有較低的剪切模量，在某些情況下表現(xiàn)出剪切稀化行為，這使得在存在細胞的情況下能夠輕松進行擠出打印。纖維蛋白、明膠甲基丙烯酸酯（GelMA）和膠原蛋白甲基丙烯酸酯（ColMA）等水凝膠被認為是生物制造各種結構用于多種應用的金標準。例如，GelMA因其在組織工程中的廣泛應用而受到廣泛關注，特別是在血管化和心臟組織工程方面，它作為3D打印的生物墨水，并在再生醫(yī)學中作為傷口愈合的粘合墨水。然而，幾何和結構完整性在3D打印的細胞負載構建物中隨著時間的推移往往會因細胞壓實和水凝膠收縮而惡化。

來自加拿大多倫多大學的Milica Radisic團隊開發(fā)了一種新的方法，該方法結合了生物水凝膠的細胞相容性和彈性聚合物的機械穩(wěn)定性，以維持立體光刻和擠出3D打印后的結構保真度。實現(xiàn)這一進展的是復合生物墨水，通過將來自聚(八亞甲基順丁烯二酸酐檸檬酸酯)（POMaC）的彈性微粒整合到生物源性水凝膠（纖維蛋白、明膠甲基丙烯酸酯（GelMA）和藻酸鹽）中來配制。這種復合生物墨水增強了3D打印構建物的彈性和塑性，有效減輕了組織壓實和腫脹。它表現(xiàn)出低剪切模量和快速交聯(lián)時間，同時具有較高的極限抗壓強度和抵抗細胞力及物理操作導致的變形能力；這歸因于彈性顆粒的堆積和應力消散，這一點通過數(shù)學建模得到了證實。體內植入研究表明，含有POMaC顆粒的構建物表現(xiàn)出更好的抵抗宿主組織應力的能力，增強了血管生成，并促進了修復性巨噬細胞的浸潤。相關工作以題為“Cell driven elastomeric particle packing in composite bioinks for engineering and implantation of stable 3D printed structures”的文章發(fā)表在2024年10月29日的期刊《Bioactive Materials》。         

1.創(chuàng)新型研究內容
本文提出了一種方法，該方法結合了生物水凝膠和彈性聚合物的優(yōu)點，形成了一種適用于立體光刻和擠出3D打印的復合顆粒生物墨水（圖1）。通過將彈性微粒整合到生物源性水凝膠中，本文設計了一種生物墨水，該墨水在自然水凝膠的支持下保持了細胞面對的生物學特性，并且在高應變下具有類似于聚合物彈性體的機械性能（圖1a）。這些彈性微粒是通過從檸檬酸、馬來酸酐和1,8-辛二醇通過縮聚反應合成的一種可紫外交聯(lián)的彈性體POMaC，以批量和滴狀微流控方法生成的。這種與細胞兼容的彈性體之前已被用作心臟組織工程中的支架，支持細胞生長，并且允許創(chuàng)建體外器官芯片模型以及體內植入的壓力傳感器。此外，POMaC還被用來生產(chǎn)AngioChip，這是一個促進體外血管化的平臺。

【用于3D打印形態(tài)穩(wěn)定的復合顆粒材料】
研究人員在各種水凝膠中嵌入POMaC顆粒（特別是纖維蛋白、GelMA和海藻酸鹽）創(chuàng)造了多功能的顆粒生物墨水，這些墨水支持基質細胞、成纖維細胞和人類誘導多能干細胞衍生的心肌細胞的重塑和組織生成，并增強血管形成，同時添加熒光以用于構建標記（圖1a和b）。微機械壓縮測試結果表明，復合材料在大范圍應變下表現(xiàn)出與其母本水凝膠相似的行為（圖1b），這有助于擠出式3D打印。剪切壓縮測試顯示，在低應變下，變形主要通過水凝膠組分傳遞，復合顆粒生物墨水表現(xiàn)出與其母本水凝膠幾乎相同的機械性能（圖1c）。然而，隨著壓縮剪切應變增加，變形通過水凝膠傳遞，使彈性顆粒相互接觸，從而抵抗施加的變形（圖1c）。因此，復合生物墨水在較高應變下表現(xiàn)得像彈性固體，最終表現(xiàn)出比其母本水凝膠顯著更高的極限抗拉強度（圖1c）。有限元建模表明，當結構受到相同的壓縮位移時，與僅有的水凝膠相比，復合材料內的von Mises應力降低（圖1d），進一步支持了復合材料抵抗壓縮的能力。這些雙模態(tài)機械性能使得顆粒復合材料在細胞培養(yǎng)和植入中表現(xiàn)出獨特的行為。

圖1 復合水凝膠生物墨水中的彈性顆粒堆積用于穩(wěn)定3D打印結構   

POMaC顆粒是通過將POMaC預聚物與聚乙二醇二甲基丙烯酸酯500（PEGDM）混合生成的，使用批量合成方法或微流控技術（圖2）。對于批量合成，本文采用懸浮聚合法，通過將POMaC聚合物注入到持續(xù)攪拌的PVA溶液中。結果，POMaC預聚物在被PVA溶液包裹后自發(fā)形成顆粒（圖2d）。這些顆粒隨后被過濾以分離出所需的尺寸，并進行UV交聯(lián)（圖2d）。本文還采用了滴狀微流控技術作為生成單分散POMaC顆粒的概念驗證（圖2ei）。本文使用了一個經(jīng)典的流動聚焦接口在一個PDMS裝置中（圖2eii）。為了抑制高粘度POMaC顆粒粘附和潤濕PDMS通道，一個20號注射器針頭被側向插入PDMS芯片，與連續(xù)相通道相交。顆粒被收集在管子里，隨后在紫外光下進行交聯(lián)（圖2ei）。

圖2 通過批量和微流控方法制備的POMaC顆粒的比較分析

【用于3D打印的混合POMaC顆粒和水凝膠生物墨水】

為開發(fā)一種既具有優(yōu)越機械穩(wěn)定性又同時保持細胞活性的3D打印生物墨水，本文將POMaC顆粒與多種水凝膠進行了整合。這種生物墨水還可以添加細胞，并且與各種水凝膠兼容（圖3a）。為確保粒子在水凝膠結構中均勻分布，在打印前必須充分混合粒子/水凝膠溶液。如果將粒子在試管中靜置幾分鐘而不受干擾，它們往往會沉降，這可能導致打印結構的不一致性，或者在使用擠出打印時導致噴嘴堵塞。首先，本文通過比較包含大于100微米的顆粒和小于100微米的顆粒的PEGDA水凝膠結構，研究了顆粒大小對打印性能的影響。打印完成后，對結構進行了成像，并量化了與原始設計的差異。在所研究的條件下，沒有顯著差異，盡管觀察到較大顆粒和顆粒濃度降低時，差異有增加的趨勢。掃描電子顯微鏡（SEM）分析GelMA/POMaC顆粒和GelMA對照的3D打印結構，揭示了POMaC顆粒帶來的形態(tài)變化。觀察到它們的加入為水凝膠基質引入了所需的紋理復雜性，這可能有助于提高機械性能和細胞粘附特性（圖3b）。   

為擴大富含POMaC顆粒的生物墨水的應用范圍，本文探索了它與不同3D打印模式的兼容性。具體來說，本文進行了立體光刻生物打印的試驗，這種方法以其高分辨率和精確度而聞名（圖3ci-iii）。此外，本文還研究了擠出打印，這種方法具有多功能性和可擴展性，并且在材料多樣性方面也表現(xiàn)出色（圖3civ-vi）。本文的結果表明，這種混合生物墨水促進了復雜結構的制造，同時賦予結構自熒光特性，可以在打印后用于成像和跟蹤（圖3d）。此外，本文還成功地展示了生物墨水與一系列水凝膠的打印能力，包括纖維蛋白、藻酸鹽和GelMA（圖3e）。

圖3 將POMaC顆粒整合到各種水凝膠中，以創(chuàng)建適用于多種3D打印應用的混合生物墨水

【混合POMaC顆粒-水凝膠生物墨水增強了構建物的機械特性】

本文將POMaC顆粒加入PEGDA水凝膠中，與僅由PEGDA組成的對照組相比，觀察到的膨脹程度有所減少。本文假設這種減少是由于嵌入在水凝膠基質中的顆粒所賦予的阻力（圖4a–c）。使用微機械測試儀測量楊氏模量顯示，含有顆粒的混合3D打印海藻酸鹽構建物的彈性顯著高于僅含海藻酸鹽的對照組（圖4d–f）。組織工程構建物必須在細胞培養(yǎng)和體內植入所需的操作步驟中保持其形狀并保持完整，以最終保留其在體內的功能。本文的實驗表明，將顆粒加入GelMA后進行3D打印，結果得到的構建物較不易破碎（圖4g）。壓縮測試（圖4h）證實了這一改進，含有POMaC顆粒的構建物表現(xiàn)出顯著更高的楊氏模量（圖4i）和更大的極限抗壓強度（圖4j）。

圖4 在水凝膠中加入POMaC顆�？梢栽黾悠錂C械穩(wěn)定性

【POMaC顆粒摻入3D打印的GelMA結構中，增強了心肌細胞的附著和收縮功能】

本文將人類誘導多能干細胞（iPSC）衍生的心肌細胞（CMs）接種到POMaC/GelMA 3D打印的結構上，并監(jiān)測它們的發(fā)展。這些細胞培養(yǎng)了10天，在此期間它們被允許擴展并表現(xiàn)出收縮活動（圖5a）。肌鈣蛋白-T（TnT）染色表明心臟組織形成更加健壯，這通過圖像分析工具進一步量化（圖5b和ci）。心臟功能也得到了評估，結果顯示含有顆粒的結構有所改善，表現(xiàn)為較低的興奮閾值（圖5cii）和增加的最大捕獲率（圖5ciii）。此外，在1Hz刺激下，含POMaC顆粒的結構位移幅度更大（圖5civ和d）   

圖5 POMaC顆粒增強3D打印GelMA構建物中心肌細胞的附著和收縮功能

【POMaC顆粒增強了復合構建物中的體外血管穩(wěn)定性】

血管形成是組織工程策略成功的關鍵。為此，本文將內皮細胞和支持細胞（牙髓干細胞DPSC）一起播種到兩種不同的基質中，這兩種基質都加入了彈性POMaC顆粒：GelMA和纖維蛋白（圖6a）。在GelMA/POMaC顆粒構建物中的血管形成得到了增強，血管直徑顯著更寬（圖6b和c）。

圖6 POMaC顆粒對血管化組織構建物中血管形成和穩(wěn)定性的影響

【POMaC顆粒增強了復合結構中的血管生成和促再生巨噬細胞的招募】

為進一步研究水凝膠支架的長期穩(wěn)定性、結構完整性和功能，本文將體內的研究從最初的10天延長到2周和4周。第2周時取出的支架的總體形態(tài)圖像顯示，與不含顆粒的組相比，含有顆粒的支架顯示出更小的支架面積（圖7a和b）。本文推測這是由于細胞浸潤增強和隨后的材料降解，這在有顆粒存在的情況下更為顯著。含有顆粒和接種細胞（ECs/DPSCs）的組中明顯的證據(jù)表明，在總體形態(tài)上支架內血管化增加（圖7a）。值得注意的是，盡管所有支架在解釋時都保持完整，但組織學分析顯示，缺乏顆粒的支架出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象，在沒有顆粒的支架中觀察到明顯的剪切和撕裂（圖7c和d），并且不含顆粒的組中殘留更多的水凝膠。   

圖7 長期體內植入帶有和不帶有細胞的POMaC顆粒/GelMA植入物

本文進一步證明了含有POMaC顆粒的組中血管滲透顯著增加，通過CD31陽性染色量化（圖8a和b）。此外，本文研究了巨噬細胞浸潤到植入物中的情況，并觀察到在4周取出的樣本中顯著增加，通過CD68（總巨噬細胞的標志物）和CD206（一種親再生、促血管生成的巨噬細胞滲入組織的標志物）的染色顯示（圖8c-f）。這些發(fā)現(xiàn)強調了POMaC顆粒不僅在增強血管化和親再生巨噬細胞浸潤方面的關鍵作用，還在于保持支架的結構完整性，從而支持體內組織整合和再生的長期過程。

圖8 將POMaC顆粒加入GelMA構建物中，可誘導植入物內血管形成和促再生巨噬細胞浸潤

2.總結與展望
本文展示的技術是3D生物打印技術發(fā)展的一個有前景的途徑，其提供了結構保真度和生物功能之間的平衡。復合墨水對各種打印方法和水凝膠的適應性強調了POMaC顆�；旌仙�物墨水在滿足多種結構和功能需求方面的潛力，以推動生物材料科學、組織工程和再生醫(yī)學應用的發(fā)展。

文章來源：
https://www.sciencedirect.com/sc ... 24004523?via%3Dihub