生物3D打印技術(shù)新突破，實(shí)現(xiàn)成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的高效分化

來源： EFL生物3D打印與生物制造

體外骨模型是研究骨組織行為和細(xì)胞響應(yīng)的重要工具，尤其在揭示特定骨病理機(jī)制和評估新療法效果方面具有關(guān)鍵作用。然而，目前的體外骨模型存在一些局限性，例如無法完全模擬生理?xiàng)l件下的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，以及在二維培養(yǎng)中無法準(zhǔn)確反映骨細(xì)胞與其三維細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)雜相互作用。此外，盡管動物模型提供了三維環(huán)境，但缺乏對細(xì)胞環(huán)境進(jìn)行精確操控的能力，且不能完全代表人體組織。

因此，開發(fā)能夠準(zhǔn)確模擬人體骨組織生理特性的三維體外模型迫在眉睫。這一模型需要在三維環(huán)境中包含初級人類細(xì)胞，并準(zhǔn)確再現(xiàn)從成骨細(xì)胞到骨細(xì)胞的整個成骨分化過程。

針對此問題，來自法國里昂的分子和超分子化學(xué)與生物化學(xué)研究所Emma Petiot開發(fā)了一種通過生物3D打印技術(shù)開發(fā)的體外骨模型，該模型能夠促進(jìn)初級人成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化過程。相關(guān)研究以“In vitro bioprinted 3D model enhancing osteoblast-to-osteocyte differentiation”為題發(fā)表在《Biofabrication》上。

本論文有關(guān)于生物3D打印骨模型，主要介紹了利用生物打印技術(shù)開發(fā)體外骨模型以促進(jìn)成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的研究。

（1）首次在生物打印的人體初級成骨細(xì)胞中表達(dá)骨細(xì)胞特異性蛋白：本研究首次在生物打印的人體初級成骨細(xì)胞中檢測到骨細(xì)胞特異性蛋白PHEX的表達(dá)，這標(biāo)志著在體外骨模型構(gòu)建方面的重要進(jìn)展。

（2）優(yōu)化水凝膠的力學(xué)性質(zhì)以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化：通過調(diào)整水凝膠的彈性模量和粘彈性行為，研究發(fā)現(xiàn)彈性模量為8 kPa且隨時間具有粘彈性行為的水凝膠最適合成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化。

（3）細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的詳細(xì)分析：研究詳細(xì)分析了細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，包括水凝膠收縮和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如纖維連接蛋白和膠原蛋白I）的分泌，揭示了細(xì)胞如何主動影響其微環(huán)境。

本研究為骨病理研究提供了新的體外模型，有助于更深入地理解骨細(xì)胞分化和骨組織工程。

1. 生物3D打印骨模型的構(gòu)建與優(yōu)化
本論文詳細(xì)介紹了生物3D打印骨模型的構(gòu)建與優(yōu)化過程。

研究者首先選擇了由明膠、藻酸鹽和纖維蛋白原組成的生物墨水，這種生物墨水已被證明適用于多種細(xì)胞類型，包括成骨細(xì)胞的增殖。接著，通過不同的交聯(lián)溶液調(diào)整生物墨水的力學(xué)性質(zhì)，包括彈性模量和粘彈性行為。具體來說，研究者測試了三種交聯(lián)條件：TGHCa、TGLCa和TGHDMEM，每種條件都旨在調(diào)整水凝膠的力學(xué)特性以更好地支持成骨細(xì)胞分化。通過動態(tài)力學(xué)分析（DMA）和透射電子顯微鏡（TEM）等表征手段，研究者評估了水凝膠的粘彈性和微孔性。最終，研究發(fā)現(xiàn)TGLCa條件（彈性模量為8 kPa且具有粘彈性行為）的水凝膠在促進(jìn)成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化方面表現(xiàn)出最佳效果。此外，研究還優(yōu)化了生物打印參數(shù)，如細(xì)胞密度和打印幾何形狀，以確保構(gòu)建的骨模型能夠準(zhǔn)確模擬體內(nèi)骨組織的生理環(huán)境。   

這些優(yōu)化措施顯著提高了骨模型的生物相容性和功能性，為骨組織工程和骨病理研究提供了新的有力工具。

圖1 生物打印構(gòu)建體中成骨細(xì)胞的增殖情況

2. 水凝膠力學(xué)性質(zhì)對成骨細(xì)胞分化的影響
本論文研究了水凝膠力學(xué)性質(zhì)對成骨細(xì)胞分化的影響。

研究者通過調(diào)整水凝膠的彈性模量和粘彈性行為，探討了這些力學(xué)性質(zhì)如何影響成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化過程。具體而言，研究者制備了三種不同力學(xué)性質(zhì)的水凝膠：TGHCa（高彈性模量和粘彈性行為）、TGLCa（低彈性模量和粘彈性行為）和TGHDMEM（低彈性模量但彈性行為）。通過動態(tài)力學(xué)分析（DMA）表征水凝膠的力學(xué)性質(zhì)，并使用透射電子顯微鏡（TEM）分析水凝膠的微孔性。結(jié)果表明，TGLCa條件的水凝膠（彈性模量為8 kPa且具有粘彈性行為）最能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖停止、堿性磷酸酶活性增加、樹突發(fā)展和骨細(xì)胞標(biāo)志物PHEX的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了水凝膠的粘彈性行為和適當(dāng)?shù)膹椥阅Ａ吭谡{(diào)控成骨細(xì)胞分化中的關(guān)鍵作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)高微孔性的水凝膠能夠改善氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散，進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化。   

這些結(jié)果揭示了水凝膠力學(xué)性質(zhì)對成骨細(xì)胞分化的深遠(yuǎn)影響，為開發(fā)更有效的骨組織工程策略提供了重要依據(jù)。

圖2 生物打印構(gòu)建體的收縮情況

3. 細(xì)胞-基質(zhì)相互作用在骨細(xì)胞分化中的作用
本論文探討了細(xì)胞-基質(zhì)相互作用在骨細(xì)胞分化中的作用。   

研究者通過生物3D打印技術(shù)構(gòu)建了包含成骨細(xì)胞的水凝膠模型，并分析了細(xì)胞如何通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白影響其微環(huán)境，從而促進(jìn)骨細(xì)胞分化。具體來說，研究者觀察到了成骨細(xì)胞在水凝膠中分泌的纖維連接蛋白和膠原蛋白I，這些蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。通過免疫組織化學(xué)染色和透射電子顯微鏡（TEM）分析，研究者發(fā)現(xiàn)，在TGLCa條件的水凝膠中，成骨細(xì)胞分泌的膠原蛋白I顯著增多，且水凝膠的收縮現(xiàn)象明顯，這表明細(xì)胞-基質(zhì)相互作用在骨細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞通過改變水凝膠的微結(jié)構(gòu)來適應(yīng)其分化需求，例如在高微孔性的水凝膠中，細(xì)胞能夠更好地?cái)U(kuò)散氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)骨細(xì)胞的成熟和分化。

這些結(jié)果表明，細(xì)胞-基質(zhì)相互作用不僅是骨細(xì)胞分化的必要條件，而且可以通過優(yōu)化水凝膠的力學(xué)性質(zhì)和微結(jié)構(gòu)來進(jìn)一步增強(qiáng)這一過程，為骨組織工程提供了新的見解和策略。   

圖3 成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白

圖4 細(xì)胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)分析   

圖5 成骨細(xì)胞形態(tài)的演變

4. 骨細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)與鑒定
本論文研究了骨細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)與鑒定在生物3D打印骨模型中的應(yīng)用。

研究者通過在優(yōu)化后的水凝膠中培養(yǎng)成骨細(xì)胞，觀察到了骨細(xì)胞特異性蛋白PHEX的表達(dá)，這是骨細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志。通過免疫組織化學(xué)染色，研究者發(fā)現(xiàn)，在TGLCa條件的水凝膠中，成骨細(xì)胞在培養(yǎng)21天后開始表達(dá)PHEX，且隨著時間的推移，表達(dá)量逐漸增加。此外，研究者還通過堿性磷酸酶（ALP）活性的檢測進(jìn)一步驗(yàn)證了骨細(xì)胞的分化過程。ALP是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，其活性在成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化過程中逐漸降低。研究結(jié)果表明，在TGLCa條件的水凝膠中，ALP活性在初期增加，隨后穩(wěn)定，這與骨細(xì)胞分化的典型過程一致。   

這些發(fā)現(xiàn)表明，通過生物3D打印技術(shù)構(gòu)建的骨模型能夠有效促進(jìn)成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化，并成功表達(dá)骨細(xì)胞特異性蛋白，為骨組織工程和骨病理研究提供了新的實(shí)驗(yàn)平臺。

圖6 堿性磷酸酶（ALP）活性的變化   

圖7 骨細(xì)胞特異性蛋白PHEX的表達(dá)

綜上所述，本論文通過生物打印技術(shù)構(gòu)建了包含成骨細(xì)胞的3D骨模型，并研究了不同水凝膠的力學(xué)性質(zhì)對成骨細(xì)胞分化的影響。研究結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞在不同水凝膠中表現(xiàn)出不同的增殖和分化行為，具體體現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶（ALP）活性以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌上。通過透射電子顯微鏡觀察，細(xì)胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)也得到了詳細(xì)分析。此外，論文還通過免疫組織化學(xué)染色鑒定了骨細(xì)胞特異性蛋白PHEX的表達(dá)情況。本研究揭示了水凝膠力學(xué)性質(zhì)在調(diào)控成骨細(xì)胞分化中的關(guān)鍵作用，為未來骨組織工程的優(yōu)化提供了重要依據(jù)。

未來可以進(jìn)一步探索機(jī)械刺激和共培養(yǎng)破骨細(xì)胞對骨模型成熟度的影響，以期實(shí)現(xiàn)更接近生理狀態(tài)的骨組織工程模型。此外，通過優(yōu)化水凝膠的力學(xué)性質(zhì)和微孔結(jié)構(gòu)，有望提高骨模型的生物相容性和功能性，為骨相關(guān)疾病的治療提供新的策略和解決方案。   

文章來源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/ad8ca6