基于水凝膠的3D打印微米級生物力學(xué)傳感器

來源： EngineeringForLife

形態(tài)發(fā)生（Morphogenesis）是胚胎細(xì)胞改變其組織形狀以建立后續(xù)器官功能所需形態(tài)的典型的生物力學(xué)過程。多層次力場與作用于異質(zhì)細(xì)胞群的生化因素之間的復(fù)雜動態(tài)關(guān)系施加了不斷演變的幾何約束，并允許發(fā)育中的胚胎穩(wěn)健地自組織器官原基。形態(tài)發(fā)生的失敗以及與遺傳和環(huán)境因素相關(guān)的“被動”機械特性與“主動”力生成之間的解耦，會產(chǎn)生先天性異常，這仍然是全球嬰兒死亡的主要原因。在歐洲，每1000個出生中就有近27個受到先天性異常的影響，33%的受影響兒童在嬰兒期未能存活。神經(jīng)管缺陷（NTDs）仍然是最常見和最嚴(yán)重的先天性畸形之一。這些缺陷是由于胚胎神經(jīng)管未能閉合造成的，這一生物物理過程長期以來一直是形態(tài)發(fā)生臨床相關(guān)范例的原因。形態(tài)發(fā)生需要胚胎細(xì)胞產(chǎn)生力并執(zhí)行機械工作來塑造其組織。這些力場的錯誤功能可能導(dǎo)致先天性畸形。理解這些動態(tài)過程需要對進化中的脊椎動物形態(tài)發(fā)生過程中的3D力學(xué)進行量化和分析。

來自意大利帕多瓦大學(xué)的Nicola Elvassore 團隊與來自英國倫敦大學(xué)學(xué)院(UCL)兒童健康研究所的Gabriel L. Galea團隊合作開發(fā)了一種具有微米級分辨率的彈性彈簧狀力傳感器，通過活體內(nèi)3D生物打印直接在生長中的雞胚閉合神經(jīng)管中制造。將校準(zhǔn)后的傳感器讀數(shù)與計算力學(xué)建模相結(jié)合，可以直接量化胚胎組織所施加的力和完成的工作。隨著它們向胚胎中線移動，閉合神經(jīng)管的兩半在神經(jīng)褶皺貼合期間達到了超過一百納牛頓的壓縮力。通過藥理學(xué)抑制Rho相關(guān)激酶以減少促閉合力，顯示出存在主動的抗閉合力，這些力逐漸加寬神經(jīng)管，必須克服這些力才能實現(xiàn)神經(jīng)管的閉合�？偟膩碚f，本文的方法發(fā)現(xiàn)強調(diào)了機械力和組織形態(tài)發(fā)生之間錯綜復(fù)雜的相互作用。相關(guān)工作以題為“Quantifying mechanical forces during vertebrate morphogenesis”的文章發(fā)表在2024年07月05日的國際頂級期刊《Nature Materials》。   

1.創(chuàng)新型研究內(nèi)容
本文提出了一種適用于脊椎動物形態(tài)力的量化方法，通過在活體雞胚內(nèi)創(chuàng)建類似彈簧的納牛頓力傳感器，采用活體內(nèi)3D（i3D）生物打印方法。這種i3D生物打印之前已經(jīng)被用于在小鼠皮膚的表皮、大腦的硬腦膜和骨骼肌的肌腱下打印毫米級結(jié)構(gòu)。本文重新開發(fā)了這項技術(shù)，以實現(xiàn)生物相容的光敏聚合物在3D彈性水凝膠中的微米級光交聯(lián)。結(jié)合活體成像顯微鏡技術(shù)，i3D生物打印的類似彈簧的力傳感器允許動態(tài)量化神經(jīng)胚形成力學(xué)。作為原理證明，本文展示了在Rho相關(guān)蛋白激酶（ROCK）抑制的胚胎中可量化的閉合力學(xué)的破壞。

【在胚胎中適應(yīng)性生物打印彈性形狀】
本文提出了一種策略，可直接在活體胚胎中生成彈性組織以適應(yīng)組織幾何結(jié)構(gòu)，并且無需專業(yè)設(shè)備，僅需現(xiàn)成的雙光子顯微鏡（圖1a）。雙光子i3D生物打印能夠在共聚焦成像的雞胚中直接創(chuàng)建具有高位置和結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性的3D形狀（圖1a,b）。優(yōu)化的實驗條件可以在解剖學(xué)上定義的興趣區(qū)域（閉合的神經(jīng)管中）可重復(fù)地產(chǎn)生預(yù)先設(shè)計的結(jié)構(gòu)（圖1b）。本文利用星形圖案展示了打印尺寸的多樣性，其中跨越了兩個數(shù)量級，從~1µm到200µm（圖1b）。

神經(jīng)管的閉合需要神經(jīng)褶的內(nèi)側(cè)貼合，從而在物理上縮小開放區(qū)域，并允許背側(cè)中線融合通過“拉鏈點”進展（圖1c）。神經(jīng)管拉鏈速度并未受到i3D打印的顯著影響。隨著拉鏈前進和胚胎繼續(xù)發(fā)育，剛性的i3D打印結(jié)構(gòu)可以被移位并從閉合管中排出（圖1d）。它們的位移表明胚胎產(chǎn)生了機械力。為量化這些力，本文改良了i3D生物打印技術(shù)，創(chuàng)建了彈性的、順從的形狀，錨定在閉合的神經(jīng)褶上，這樣它們的變形就可以作為神經(jīng)褶內(nèi)側(cè)貼合產(chǎn)生的力的讀數(shù)（圖1c）。本文將這些結(jié)構(gòu)稱為活體內(nèi)力學(xué)感受水凝膠（iMeSHs）。   

圖1 i3D生物打印技術(shù)具有精確確定的位置、幾何形狀和剛度。

【從iMeSH變形推斷形態(tài)發(fā)生力學(xué)】
整合到神經(jīng)上皮中的iMeSH結(jié)構(gòu)在閉合腔內(nèi)受到中外側(cè)壓縮（圖2）。本文測試了各種潛在的iMeSH幾何形狀，以通過形狀變形來量化力。首先，使用具有定義的楊氏模量的玻璃基底上的橋梁形狀的定制有限元方法（FEM）模型，顯示可以預(yù)測特定形狀的力-變形響應(yīng)。可以在神經(jīng)褶之間將簡單的iMeSH條打印到不同的深度，并且可以在一個胚胎內(nèi)打印多個形狀。當(dāng)神經(jīng)褶合攏時，這些形狀可以變形，產(chǎn)生非常均勻的曲率，證明了iMeSH材料的同質(zhì)性（圖2a）。兩個特性使得這種形狀不適合用于力的量化。iMeSH和神經(jīng)褶之間的接觸面非常狹窄，產(chǎn)生的應(yīng)力峰值通常導(dǎo)致條狀物從組織上脫離。此外，形狀的應(yīng)力-應(yīng)變關(guān)系完全是非線性的，以至于由其施加的力導(dǎo)致的變形完全取決于其初始曲率或力的應(yīng)用方向。本文開發(fā)了第二種形狀以提高變形和力應(yīng)用的可預(yù)測性：沿著神經(jīng)褶的硬桿通過兩個V形彈簧相互連接（圖2b）。這種形狀可以在體內(nèi)重現(xiàn)性地打印，并在受壓時產(chǎn)生V形彈簧的內(nèi)側(cè)變窄（圖2b）。對單個形狀的定制FEM建模顯示，神經(jīng)褶產(chǎn)生了低至數(shù)百納牛頓的力。然而，這種形狀的變形-力關(guān)系在生物學(xué)相關(guān)的變形幅度上是高度非線性的。在小變形下，個性化FEM模型顯示，神經(jīng)管需要77.9±39.1納牛頓（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=4；組織接觸表面長170µm）來壓縮iMeSH的V形10%的初始寬度（8µm）。  

圖2 優(yōu)化力傳感器的形狀以量化形態(tài)發(fā)生力

相比之下，簡單的圓柱形狀在相關(guān)變形范圍內(nèi)提供了準(zhǔn)線性的變形-力關(guān)系（圖2c）。整合到神經(jīng)褶之間的圓柱形狀阻止了相鄰神經(jīng)管的閉合，形成了一個局部開放的缺陷（圖3a,b）。在長時間尺度上，側(cè)翼拉鏈點的融合進展包圍著打印物體，從經(jīng)驗上將局部中外側(cè)貼合與吻尾向拉鏈分離。具有過度結(jié)構(gòu)剛度的圓柱也阻止了拉鏈前進接觸iMeSH時的神經(jīng)褶貼合，但沒有顯示出可以從中量化力的變形。因此，必須調(diào)整iMeSH力傳感器的結(jié)構(gòu)以匹配組織力產(chǎn)生特性。

根據(jù)特定結(jié)構(gòu)的FEM模型進行的力量化，可以通過理想化的圓柱形狀來近似。使用FEM，本文推導(dǎo)了一個參數(shù)化方程，通過該方程，iMeSH圓柱的變形可以作為施加力的通用讀數(shù)（圖3c-e）。模擬的圓柱狹窄和對側(cè)彈性擴張與由側(cè)面接觸施加的機械力呈準(zhǔn)線性相關(guān)（圖3e）。這種線性關(guān)系在高達約20%的應(yīng)變（定義為圓柱寬度的百分比變化）時是可靠的，盡管可以使用特定形狀的FEM來量化更大變形的力。在生物信息學(xué)中預(yù)測的iMeSH圓柱的中壓縮和垂直伸長在體內(nèi)被觀察到（圖3f）。   
在發(fā)育的晚期時間點，即菱腦頸神經(jīng)孔閉合完成后，神經(jīng)管繼續(xù)壓縮iMeSH力傳感器。圓柱的中外側(cè)狹窄相對于其原始寬度允許計算力（圖3g）。鑒于高變形幅度和圍繞圓柱圓周的接觸點的演變，晚期時間點獲得的力值不應(yīng)被視為絕對值。然而，聚合物材料屬性隨時間非常穩(wěn)定：打印后具有80.56±0.14 kPa的AFM計算硬度的iMeSH在15天后保持了80.58±0.35 kPa的硬度。圓柱形狀的FEM模型顯示，8µm的中壓需要神經(jīng)管施加54.98±11.20納牛頓（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=4；組織接觸表面，~75µm長）。因此，兩種建模形狀之間每單位長度施加的力的量化是一致的。施加到iMeSH圓柱上的力以低能量的彈性能量形式存儲（圖3h）。經(jīng)過轉(zhuǎn)換，發(fā)現(xiàn)1 pJ可以存儲在大約1×107個ATP分子中，盡管化學(xué)能到機械能的生物轉(zhuǎn)換可能非常低效。

圖3 對閉合神經(jīng)管施加的內(nèi)側(cè)力進行量化   

【神經(jīng)胚形成中的閉合前力與抗閉合力平衡】

iMeSH力傳感器生物打印與時間延遲成像的結(jié)合，使得在體內(nèi)動態(tài)描繪形態(tài)發(fā)生力成為可能（圖4a,b）。為了量化力，本文將iMeSH圓柱附著在神經(jīng)褶之間懸掛。在胚胎的神經(jīng)褶間有iMeSH圓柱的情況下，神經(jīng)上皮細(xì)胞保持了相對于周圍組織的預(yù)期F-actin富集（圖3i）。沿著iMeSH形狀沒有觀察到異常壓縮、肌動蛋白肌球蛋白的破壞或組織的積累。本文預(yù)計，壓縮水凝膠的細(xì)胞會暴露于與它們通常經(jīng)歷的不同硬度和機械力中。細(xì)胞的機械變形預(yù)計會改變張力或壓力，眾所周知，這會觸發(fā)包括壓電通道開放和YAP核定位在內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)。例如，本研究團隊的近期研究表明：小鼠胚胎表面外胚層的YAP核水平與局部細(xì)胞邊界張力有關(guān)。與比細(xì)胞遇到的自然環(huán)境更硬的水凝膠材料接觸所觸發(fā)的局部機械傳導(dǎo)事件，可能會導(dǎo)致不同的細(xì)胞反應(yīng)。例如，在對醫(yī)療植入物的異物反應(yīng)背景下已經(jīng)顯示了這一點。機械傳導(dǎo)可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄變化、炎癥介質(zhì)的釋放或其他組織變化。然而，這些不太可能改變本文對所描述的方法的解釋，因為這些變化所需的時間尺度與報告的力量測量的時間尺度不同。

頂端神經(jīng)上皮背側(cè)彎曲，而懸掛在神經(jīng)褶之間的iMeSH結(jié)構(gòu)僅在局部抵抗這種變形。神經(jīng)褶的中線貼合對iMeSH邊緣施加增量壓縮力，導(dǎo)致其向中線位移（圖4a）。隨著胚胎施加壓縮力，iMeSH圓柱的應(yīng)變（定義為寬度的百分比變化）逐漸增加，在一至兩小時的發(fā)育相關(guān)窗口內(nèi)達到約100納牛頓，然后趨于平穩(wěn)或開始下降（圖4b-e）。

藥理學(xué)上抑制肌球蛋白激活激酶ROCK被認(rèn)為可以阻止雞和哺乳動物胚胎中的神經(jīng)褶升高。本文觀察到F-actin的丟失，如之前所報道，以及在ROCK抑制的胚胎中神經(jīng)褶逐漸變寬（圖4c）。這呈現(xiàn)出額外的力量化挑戰(zhàn)：像懸臂梁這樣的力傳感器簡單地放置在神經(jīng)褶之間，僅當(dāng)周圍組織壓縮它們時才會變形。將iMeSH圓柱直接錨定到胚胎組織上解決了這個問題，允許它們通過組織擴張來拉伸（圖4c-e）。ROCK抑制的胚胎每單位時間產(chǎn)生的力比載體對照組少：它們在60分鐘內(nèi)的最大沖量顯著更低。盡管如此，值得注意的是，ROCK抑制的胚胎施加的絕對抗閉合能量與對照組的促閉合相當(dāng)（圖4f）。潛在的力生成機制，沒有被Rho/ROCK激活的阻斷所打斷，包括持續(xù)的細(xì)胞增殖、流體靜力的細(xì)胞外基質(zhì)擴張和細(xì)胞遷移。

圖4 在神經(jīng)胚形成過程中對形態(tài)發(fā)生力學(xué)進行動態(tài)量化

2.總結(jié)與展望
以高空間分辨率和位置精度打印的iMeSH力傳感器，結(jié)合時間延遲實時成像，使得能夠量化在脊椎動物神經(jīng)管閉合過程中產(chǎn)生的機械能。iMeSH能夠量化胚胎組織產(chǎn)生的納米牛頓級別的力，無需專業(yè)設(shè)備，僅需現(xiàn)成的雙光子顯微鏡和液體聚合物。這項技術(shù)具有高度的通用性，輕松適應(yīng)初始形態(tài)和力產(chǎn)生方向的差異，允許動態(tài)描繪壓縮力和拉伸力。通過光打印一個簡單的圓柱形狀，可以使用一個通用方程從變形中計算力。其他方法可以用來量化皮科牛頓級別的力、壓力、分子應(yīng)變或偏轉(zhuǎn)，但iMeSH在以高分辨率量化在不可預(yù)測的方向上應(yīng)用的力方面是獨一無二的，具有可變組織幾何結(jié)構(gòu)的能力。   

文章來源：
https://www.nature.com/articles/s41563-024-01942-9