Chemical Engineering Journal 3D打印雙離子時(shí)序釋放平臺(tái)促骨缺損中神經(jīng)-血管網(wǎng)...

大段骨缺損早期神經(jīng)-血管網(wǎng)絡(luò)難以重建是骨再生修復(fù)面臨的幾個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一。近日，武漢理工大學(xué)的戴紅蓮教授通過3D打印雙離子時(shí)序釋放平臺(tái)促進(jìn)了骨缺損中神經(jīng)-血管網(wǎng)絡(luò)重建，該文章名為“3D-printed dual-ion chronological release functional platform reconstructs neuro-vascularizationnetwork for critical-sized bone defect regeneration”，發(fā)表在Chemical Engineering Journal上。本研究設(shè)計(jì)了一種3D打印的含鎂明膠微球和摻鋅生物玻璃的α-磷酸三鈣支架，用于重建大段骨缺損的神經(jīng)-血管網(wǎng)絡(luò)，用于適配神經(jīng)和血管再生在骨缺損發(fā)生后立即開始，并在隨后的成骨分化中起關(guān)鍵作用的生物學(xué)過程。結(jié)果表明，含鎂明膠微球可以調(diào)節(jié)Mg²⁺的釋放速率，實(shí)現(xiàn)Mg²⁺的早期完全釋放，從而有效增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力和PC12細(xì)胞的神經(jīng)再生能力，同時(shí)避免Mg²⁺高濃度對(duì)晚期成骨的潛在抑制。此外，摻鋅生物玻璃確保了Zn²⁺的長期釋放，從而促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性和成骨分化。在大鼠顱骨大段缺損模型中，3D打印的α-磷酸三鈣支架顯著增強(qiáng)了神經(jīng)-血管網(wǎng)絡(luò)密度，并在促進(jìn)新骨形成方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。因此，該時(shí)序釋放平臺(tái)有望用于修復(fù)大段骨缺損，并為修復(fù)材料的設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。

背景介紹

大段骨缺損是骨科臨床治療中的難題。目前，常用的治療方法包括自體移植、同種異體移植和人工骨移植等策略。自體移植策略被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”，其中一個(gè)重要原因是自體骨含有豐富的神經(jīng)-血管網(wǎng)絡(luò)。因此，人工骨移植不能實(shí)現(xiàn)理想的骨修復(fù)效果可能是因?yàn)楹鲆暳松窠?jīng)-血管網(wǎng)絡(luò)的快速早期重建。

血管化在大段骨缺損修復(fù)中起著重要作用，它在骨修復(fù)過程中提供營養(yǎng)和因子以避免骨組織壞死，并通過促進(jìn)神經(jīng)肽受體的早期表達(dá)加速骨缺損的修復(fù)。此外，血管化還為骨相關(guān)神經(jīng)再生提供了理想的環(huán)境。同時(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)在骨組織工程中的有益作用也已得到了證實(shí)。骨缺損發(fā)生后，缺損部位的神經(jīng)修復(fù)在24小時(shí)內(nèi)達(dá)到高峰。神經(jīng)纖維通過分泌神經(jīng)肽如降鈣素基因相關(guān)肽和Sema3A參與血管修復(fù)和成骨分化。

在本研究中，作者以3D打印的α-磷酸三鈣（α-TCP）水泥支架作為基質(zhì)材料，引入含鎂的明膠微球（Mg-GMS）和摻鋅的生物玻璃（Zn-BG），構(gòu)建了具有雙離子時(shí)序釋放功能的3D打印α-TCP支架（TCP/Zn-BG/Mg-GMS）。Mg-GMS用于控制Mg2+的釋放速度，以促進(jìn)早期神經(jīng)-血管化網(wǎng)絡(luò)的重建。而Zn-BG則用于調(diào)節(jié)支架的初始pH值，并確保Zn2+的長期釋放，以促進(jìn)成骨作用。3D打印支架提供了機(jī)械支撐和互連孔結(jié)構(gòu)。該研究證實(shí)了復(fù)合支架的血管化和神經(jīng)化能力及其對(duì)成骨分化的影響。最后，在體內(nèi)建立了8毫米的大鼠顱骨大段骨缺損模型并對(duì)支架功能進(jìn)行驗(yàn)證（圖1）。通過微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT）和組織切片染色，探討了神經(jīng)-血管化網(wǎng)絡(luò)重建對(duì)成骨的影響。這一研究策略提供了一種具有雙離子時(shí)時(shí)序釋放功能的3D打印α-TCP支架，有望作為修復(fù)大段骨缺損的骨移植物，并揭示了神經(jīng)-血管化網(wǎng)絡(luò)重建在修復(fù)大段骨缺損中的作用。

圖1.3D打印的雙離子釋放支架，用于重建神經(jīng)-血管化網(wǎng)絡(luò)以促進(jìn)骨再生

u  材料與方法

BG粉末通過溶膠-凝膠法制備。簡而言之，將10.4 g TEOS、0.46 g TEP、1.52 g Ca(NO3)2·4H2O溶解在100 mL無水乙醇溶液中。然后在無水乙醇溶液中加入鹽酸（0.5 mol/L）調(diào)節(jié)pH值，并使用Pluronic® F-127作為模板�；旌先芤涸�40°C水浴中慢慢攪拌以蒸發(fā)溶劑。最后，將粉末在600°C下加熱5小時(shí)得到BG。為了制備Zn-BG粉末，將10.4 g TEOS、0.46 g TEP、1.52 g Ca(NO3)2·4H2O、0.152 g Zn(NO3)2·6H2O溶解在100 mL無水乙醇溶液中，其余步驟相同。

Mg-GMS通過W/O乳化交聯(lián)法制備。簡而言之，在三頸燒瓶中加入30 mL液體石蠟和3 mL Span-80作為油相，并在50°C下以500 r/min攪拌混合。將葡萄糖酸鎂和明膠按適當(dāng)質(zhì)量比（2:1和1:1）溶解在去離子水中，形成混合溶液作為水相。然后將5 mL混合溶液滴入油相中，保持連續(xù)攪拌。15分鐘后，將反應(yīng)轉(zhuǎn)移到冰水�。�4℃）中，慢慢加入1 mL EDC溶液。反應(yīng)1小時(shí)后停止，然后通過過濾分離所得的GMS，用異丙醇清洗，并在通風(fēng)處干燥24小時(shí)。根據(jù)葡萄糖酸鎂和明膠的比例，將樣品分類為2:1 Mg-GMS組和1:1 Mg-GMS組。

將3 g α-TCP粉末和xBG（x= 0%、5%、10%、15%的質(zhì)量比）粉末均勻混合。然后將海藻酸鈉粉末加入去離子水中，制備10% w/v的海藻酸鈉凝膠。將海藻酸鈉凝膠加入到α-TCP和BG的粉末混合物中，通過機(jī)械攪拌直至形成糊狀，得到打印墨水。通過3D打印機(jī)（SunP BioMaker 2）用混合漿料制作TCP/BG復(fù)合支架。3D打印噴嘴直徑為500 μm，螺旋擠出速度為0.5–1 mm³/s，打印速度設(shè)定為5–15 mm/s，打印層厚度為500 μm。支架的主體打印完成后，將樣品浸入10%磷酸溶液中進(jìn)行5分鐘的交聯(lián)反應(yīng)，然后用去離子水沖洗三次并在室溫下干燥。

u  結(jié)果與討論

明膠微球（GMS）因其良好的生物相容性和可控的降解性能，常被認(rèn)為是理想的藥物載體。Mg2+對(duì)神經(jīng)-血管化網(wǎng)絡(luò)的重建具有積極作用，但其治療效果具有階段依賴性。因此，有必要在早期釋放Mg2+以促進(jìn)神經(jīng)-血管化網(wǎng)絡(luò)的重建，而在后期不釋放Mg2+以防止礦化。在本研究中，通過將鎂和GMS按不同比例結(jié)合，調(diào)節(jié)Mg2+的釋放濃度和時(shí)間。在第1天和第3天，2:1 Mg-GMS組的Mg2+釋放濃度高于1:1 Mg-GMS組。而在第7天，兩組均未釋放Mg2+。結(jié)果證實(shí)，通過改變鎂和GMS的復(fù)合比例，可以調(diào)節(jié)早期Mg2+的釋放濃度，從而更有效地促進(jìn)神經(jīng)和血管的生長。另一方面，Mg2+的釋放時(shí)間由GMS的降解時(shí)間決定，GMS的降解能力可以通過交聯(lián)程度來調(diào)節(jié)。GMS的可控降解確保了Mg2+在一定時(shí)間內(nèi)釋放，而不會(huì)在后期阻礙礦化。根據(jù)先前的研究，兩組Mg-GMS釋放的Mg2+濃度均在安全范圍內(nèi)。因此，選擇2:1 Mg-GMS組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

制備了不同粒徑的Mg-GMS，以探索TCP/Mg-GMS打印墨水的打印能力。Mg-GMS的粒徑可以通過改變攪拌速度來控制。當(dāng)Mg-GMS的最大粒徑大于500 μm時(shí)，打印過程中打印噴嘴會(huì)被Mg-GMS堵塞，導(dǎo)致打印過程中斷。當(dāng)Mg-GMS的最大直徑小于300 μm時(shí)，打印支架的線條結(jié)構(gòu)保持完整，且隨著Mg-GMS的降解，表面出現(xiàn)了多級(jí)孔結(jié)構(gòu)。因此，選擇粒徑小于300 μm的Mg-GMS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

先前的研究表明，Zn這一重要微量元素在骨重建中起著至關(guān)重要的作用。在成功制備TCP/BG復(fù)合支架的基礎(chǔ)上，制備了TCP/Zn-BG復(fù)合支架。研究了Zn-BG在復(fù)合支架表面的分布情況。根據(jù)元素映射結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Si、O和Zn均勻分布在復(fù)合支架的表面，表明Zn2+成功摻入BG中且Zn-BG分布均勻�；�于上述實(shí)驗(yàn)，確定了BG的復(fù)合比例，并將Zn-BG制備為Zn2+釋放平臺(tái)。然后制備Mg-GMS，選擇2:1 Mg-GMS組作為Mg2+釋放平臺(tái)。以3D打印磷酸鈣水泥支架為基質(zhì)材料，結(jié)合Zn-BG和Mg-GMS，形成3D打印雙離子時(shí)間釋放功能平臺(tái)。與Mg-GMS在PBS中的直接釋放相比，TCP/Zn-BG/Mg-GMS的Mg2+釋放速率在前三天更加溫和，釋放時(shí)間也略有延長。但TCP/Zn-BG/Mg-GMS中的Mg2+仍可在早期完全釋放。另一方面，Zn2+的釋放時(shí)間可持續(xù)長達(dá)27天。

TCP/BG的抗壓強(qiáng)度為15.44± 2.15 MPa，TCP/Zn-BG的抗壓強(qiáng)度與之相比無顯著變化。然而，TCP/Zn-BG/Mg-GMS的抗壓強(qiáng)度下降至12.59 ± 1.38 MPa。TCP/Zn-BG/Mg-GMS機(jī)械性能下降的主要原因是添加Mg-GMS增加了支架的孔隙率�？紫堵实脑黾佑兄�于提高骨整合，但往往以機(jī)械性能為代價(jià)。然而，TCP/Zn-BG/Mg-GMS的抗壓強(qiáng)度仍滿足松質(zhì)骨的機(jī)械要求（4–12 MPa）。此外，通過調(diào)整GMS的含量，可以在很大范圍內(nèi)調(diào)節(jié)支架的表面孔結(jié)構(gòu)。這使得支架可以根據(jù)不同骨缺損部位的特定結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行調(diào)整。在骨缺損修復(fù)和再生中，孔徑大于50 μm有利于成骨質(zhì)量提高，血管組織生長的最小孔徑大于100 μm，微孔（孔徑小于10 μm）有利于細(xì)胞粘附和蛋白質(zhì)吸附。因此，在開發(fā)支架時(shí)，具有分級(jí)孔結(jié)構(gòu)是一個(gè)重要考慮因素。在本研究中，通過BG和GMS的降解，在復(fù)合支架表面形成了微孔和大孔結(jié)構(gòu)，并通過3D打印構(gòu)建了互連孔結(jié)構(gòu)。三組復(fù)合支架兩個(gè)月內(nèi)質(zhì)量損失分別約為19 wt%、21 wt%和36 wt%。與TCP/BG和TCP/Zn-BG相比，TCP/Zn-BG/Mg-GMS具有更好的降解能力。材料的降解有助于新骨組織替代植入材料。

圖2. 3D打印雙離子時(shí)序釋放支架的表征。(A - C)不同粒徑Mg-GMS的TCP/Mg-GMS打印墨水的打印性測試。(D)TCP/Mg-GMS打印墨水的流變測試。(E)不同復(fù)合比例下的Mg2+釋放動(dòng)力學(xué)。(F)復(fù)合支架的抗壓強(qiáng)度和(G)失重率。TCP/Zn-BG/Mg-GMS支架中Mg2+ (H) 和Zn2+ (I) 的釋放動(dòng)力學(xué)。(J)TCP/BG、TCP/Zn-BG和TCP/Zn-BG/Mg-GMS支架的SEM圖像。(K)TCP/Zn-BG支架的EDS圖譜。

骨組織中的血管網(wǎng)絡(luò)為成骨提供了必需的營養(yǎng)、氧氣和生長因子。因此，血管化對(duì)于支架的再生性能至關(guān)重要。接下來，研究檢查了復(fù)合支架的血管生成能力�；�/死細(xì)胞染色和CCK-8試驗(yàn)的結(jié)果顯示，與其他兩組相比，TCP/Zn-BG/Mg-GMS中的HUVECs細(xì)胞活力和增殖顯著增加。Transwell試驗(yàn)用于測試HUVECs的遷移能力。TCP/Zn-BG/Mg-GMS中的遷移HUVECs數(shù)量顯著高于其他兩組。管狀形成試驗(yàn)用于評(píng)估HUVECs的血管化過程。在TCP/Zn-BG/Mg-GMS中觀察到較大的管狀結(jié)構(gòu)，與TCP/BG和TCP/Zn-BG形成鮮明對(duì)比，表明Mg2+從復(fù)合支架中釋放后具有優(yōu)異的血管生成活性。分支總長度的結(jié)果清楚地表明，TCP/Zn-BG/Mg-GMS中的計(jì)算參數(shù)遠(yuǎn)高于其他兩組。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了TCP/Zn-BG/Mg-GMS對(duì)血管生長具有更好的誘導(dǎo)效果�？傊�，TCP/Zn-BG/Mg-GMS復(fù)合支架對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)的重建起到了積極作用。神經(jīng)發(fā)生對(duì)于骨修復(fù)也至關(guān)重要。我們通過使用雪旺細(xì)胞（SCs）的活/死細(xì)胞染色和CCK-8試驗(yàn)，評(píng)估了三種復(fù)合支架的細(xì)胞相容性。結(jié)果顯示，TCP/Zn-BG/Mg-GMS中的SCs數(shù)量顯著高于其他兩組。神經(jīng)生長因子（NGF）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是調(diào)節(jié)神經(jīng)生長的重要介質(zhì)。RT-PCR分析用于評(píng)估這兩種因子的表達(dá)。結(jié)果顯示，與其他兩組相比，TCP/Zn-BG/Mg-GMS表現(xiàn)出最高的基因表達(dá)。ELISA用于測定三組復(fù)合支架上種植的SCs的NGF分泌水平。結(jié)果顯示，TCP/Zn-BG/Mg-GMS中的NGF分泌水平顯著高于其他兩組，表明Mg2+有利于神經(jīng)修復(fù)。軸突萌發(fā)是外周神經(jīng)再生的關(guān)鍵決定因素。因此，使用PC12細(xì)胞研究復(fù)合支架的軸突萌發(fā)能力，以評(píng)估神經(jīng)再生能力。結(jié)果顯示，TCP/BG和TCP/Zn-BG之間沒有顯著差異，而TCP/Zn-BG/Mg-GMS表現(xiàn)出最佳的神經(jīng)突生長。上述結(jié)果表明，TCP/Zn-BG/Mg-GMS復(fù)合支架對(duì)血管和神經(jīng)修復(fù)起到了積極作用。

圖3. 復(fù)合支架在體外促進(jìn)血管化和神經(jīng)再生的能力。體外通過活/死細(xì)胞染色（A）和CCK-8試驗(yàn)（B）評(píng)估HUVECs的活力和增殖。Transwell試驗(yàn)（C和D）測試HUVECs的遷移能力。管狀形成試驗(yàn)（E）和分支總長度（F）評(píng)估HUVECs的血管化過程。體外通過活/死細(xì)胞染色（G）和CCK-8試驗(yàn)（H）評(píng)估SCs的活力和增殖。第5天PC12細(xì)胞的免疫染色圖像（I）。神經(jīng)突長度的定量分析（J）。（n = 15）。RT-PCR分析評(píng)估FGF（K）和VEGF（L）基因的表達(dá)。NGF（M）和BDNF（N）的RT-PCR分析。ELISA顯示種植在復(fù)合支架上的SCs的NGF分泌（O）。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。

研究通過使用8毫米的大鼠顱骨大段骨缺損模型，進(jìn)一步研究了復(fù)合支架在體內(nèi)的骨再生能力。使用micro-CT和組織學(xué)分析評(píng)估了第6周和第12周的骨恢復(fù)情況。與TCP/BG相比，TCP/Zn-BG有更多的新骨生長，表明Zn2+的長期釋放有利于成骨，而TCP/Zn-BG/Mg-GMS在三組中對(duì)新骨生長的效果最好。新生骨組織的定量分析結(jié)果顯示，TCP/Zn-BG/Mg-GMS的新生骨的骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）和骨密度（BMD）顯著高于其他兩組。通過組織學(xué)分析（H&E染色和MT染色），對(duì)新生骨組織進(jìn)行了評(píng)估。所有組在植入后均未觀察到明顯的炎癥反應(yīng)或壞死。這些結(jié)果表明，TCP/Zn-BG/Mg-GMS中新骨組織的數(shù)量高于其他兩組，表明TCP/Zn-BG/Mg-GMS具有更快和更好的骨再生能力。此外，從H&E和MT切片中發(fā)現(xiàn)，TCP/Zn-BG/Mg-GMS在支架內(nèi)部有更多的骨組織生長。這表明通過Mg-GMS和BG的降解形成的多級(jí)孔結(jié)構(gòu)有利于骨組織向支架內(nèi)部生長，也表明這種多級(jí)孔結(jié)構(gòu)有利于加速材料在體內(nèi)的降解行為。這為新骨組織最終替代植入材料的可能性打開了大門。此外，從MT染色切片中發(fā)現(xiàn)，TCP/Zn-BG/Mg-GMS中的新生血管形成顯著多于其他組，這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明TCP/Zn-BG/Mg-GMS能夠促進(jìn)血管化骨再生。

圖4. 大鼠大段骨缺損的骨再生情況。術(shù)后第6周和第12周，(A)不同組在冠狀面和矢狀面上的典型CT重建圖像。(B) 和 (C)顱骨大段骨缺損的微CT定量分析。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。

圖7. 大鼠大段骨缺損的骨再生和神經(jīng)-血管化。(A)H&E和MT染色。(B)從顱骨大段缺損樣本中進(jìn)行的CD31（血管，紅色）和β3-微管蛋白（神經(jīng)，綠色）共染色。

結(jié)果與討論

在骨修復(fù)過程中，神經(jīng)-血管化網(wǎng)絡(luò)的重建在成骨過程中起著關(guān)鍵作用。因此，研究設(shè)計(jì)了一個(gè)3D打印的雙離子時(shí)序釋放功能平臺(tái)，以重建神經(jīng)-血管化網(wǎng)絡(luò)，用于修復(fù)大段骨缺損。摻鋅生物玻璃（Zn-BG）中Zn2+的長期釋放能夠有效上調(diào)Runx-2和OCN的表達(dá)，從而促進(jìn)BMSCs的成骨分化。Mg-GMS可以調(diào)節(jié)Mg2+的釋放時(shí)間和速度，有效激活VEGF和NGF的表達(dá)，以促進(jìn)神經(jīng)-血管化網(wǎng)絡(luò)的重建。研究還使用該功能平臺(tái)修復(fù)了大鼠的大段骨缺損。根據(jù)放射學(xué)和組織學(xué)檢查，3D打印的雙離子時(shí)序控釋支架顯著促進(jìn)了早期血管化和神經(jīng)發(fā)生，從而促進(jìn)最終的骨再生和重塑。因此，上述支架有望用作修復(fù)大段骨缺損的骨移植物，并為修復(fù)材料的設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。

Xia Y, Jing X, Wu X, et al. 3D-printed dual-ion chronological release functional platform reconstructs neuro-vascularization network for critical-sized bone defect regeneration[J]. Chemical Engineering Journal, 2023, 465: 143015.  https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.143015