3D打印可自固化仿生松質(zhì)骨陶瓷基支架協(xié)同金屬-多酚納米顆粒治療感染性骨缺損

來源： EngineeringForLife

感染性骨缺損是一類由微生物感染引起的骨損傷或缺損，常由嚴(yán)重污染的骨折或血源性感染引起，目前臨床上對(duì)感染性骨缺損的治療主要通過感染控制和骨缺損重建，其中使用抗生素骨水泥抑制細(xì)菌以及骨移植修復(fù)技術(shù)是最常用的治療方法，但存在細(xì)菌耐藥性增加、需要二次取出骨水泥等問題。因此通過組織工程技術(shù)制備兼具抗感染與促成骨效應(yīng)的生物支架是解決此類疾病的研究熱點(diǎn)。

近日，受臨床骨水泥固化性能啟發(fā)，來自四川大學(xué)錢志勇教授團(tuán)隊(duì)和劉顯教授團(tuán)隊(duì)利用α-磷酸三鈣（α-TCP），β-磷酸三鈣（β-TCP），明膠（Gelatin）和聚乙烯醇（PVA）構(gòu)建生物墨水，并采用低溫3D打印技術(shù)制備具有可自固化功能的仿松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)和成分的人工骨支架并負(fù)載具有金屬-多酚網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的茶多酚-鎂（TP-Mg）納米顆粒實(shí)現(xiàn)骨誘導(dǎo)能力、抗菌特性和抗炎特性協(xié)同解決感染性骨缺損難題。本文第一作者為成都大學(xué)胡旭麟博士以及四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院陳嬌博士，感謝重慶醫(yī)科大學(xué)楊舒皓碩士，成都大學(xué)鄔浩明碩士，河南科技大學(xué)賀劍博士等人為論文的幫助，特別感謝EngineeringForLife（EFL）團(tuán)隊(duì)的幫助，使用打印機(jī)型號(hào)：EFL-BP-6601。相關(guān)研究以題為“3D Printed Multifunctional Biomimetic Bone Scaffold Combined with TP-Mg Nanoparticles for the Infectious Bone Defects Repair”發(fā)表于《Small》。

圖1 研究流程示意圖

本研究提出了一種利用將具有自固化性能的α-磷酸三鈣(α-TCP)與β-磷酸三鈣(β-TCP)復(fù)合，通過低溫3D打印構(gòu)建仿生松質(zhì)骨支架體系(α/β-TCP)，并將明膠作為有機(jī)相保存在支架內(nèi)部，隨后負(fù)載金屬-多酚網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的TP-Mg納米顆粒，在調(diào)控感染性骨缺損早期微環(huán)境的同時(shí)，促進(jìn)晚期骨再生愈合，在感染性骨缺損的治療中具有良好的應(yīng)用前景（圖1）。  

圖2 金屬-多酚納米顆粒以及生物墨水表征

首先作者通過透射電子顯微鏡圖像（圖2A），zeta電位測試（圖2B）以及傅里葉變換紅外光譜（圖2C）驗(yàn)證了TP-Mg納米粒子的制備。為了驗(yàn)證α-TCP的固化性能，作者通過使生物墨水倒置在瓶中觀察期流動(dòng)性能。為了探究適宜的打印條件以及生物墨水配比，作者討論了不同打印溫度以及不同α-TCP含量的墨水?dāng)D出性能，最終發(fā)現(xiàn)在打印溫度（15℃-30℃）窗口下能夠較好的擠出0%-30%α-TCP含量的生物墨水，并通過流變學(xué)進(jìn)一步驗(yàn)證墨水的打打印性。   

圖3 復(fù)合支架的宏觀微觀形貌以及基本性能表征

圖3A顯示了3D打印復(fù)合陶瓷支架的宏觀照片，在掃描電子顯微鏡下（圖3B）觀察到貫穿大孔結(jié)構(gòu)同時(shí)，在更微觀角度下發(fā)現(xiàn)α-TCP水合在β-TCP無機(jī)鹽顆粒表面以及相互連接的明膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)松質(zhì)骨宏觀微觀結(jié)構(gòu)以及成分的多級(jí)仿生。進(jìn)一步低，通過XRD驗(yàn)證了α-TCP向CDHA的相變（圖3C），隨后作者對(duì)支架的孔隙率，吸水率，表面粗糙度和親水性能進(jìn)行表征（圖3E-H）。   

圖4 復(fù)合支架的力學(xué)性能，礦化行為和降解行為

高溫?zé)�結(jié)的陶瓷支架往往具有脆斷性，而低溫3D打印技術(shù)由于支架內(nèi)部有機(jī)相的保留避免了在高強(qiáng)度壓縮下的脆斷行為（圖4A），同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)，α/β-TCP支架的力學(xué)強(qiáng)度與α-TCP的比例呈正相關(guān)（圖4B），并且支架的力學(xué)強(qiáng)度隨著水合時(shí)間（1、3和6 h）逐漸增強(qiáng)，最終超過100MPa（圖4D）。藥物釋放實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)出藥物良好的釋放行為（圖4E）。此外，作者對(duì)支架的礦化行為以及降解行為進(jìn)行了驗(yàn)證（圖4F-H）。   

圖5 復(fù)合支架的生物相容性評(píng)價(jià)

通過細(xì)胞活死染色，CCK-8分析和掃描電鏡下細(xì)胞黏附行為觀察出復(fù)合支架的良好生物相容性（圖5A-D），但也觀察到30α/β-TCP@50TP-Mg支架對(duì)細(xì)胞增殖有一定的抑制作用。

圖6 復(fù)合支架的體外成骨效應(yīng)

體外ALP和茜素紅實(shí)驗(yàn)觀察到30α/β-TCP@10TP-Mg 組表現(xiàn)出最顯著的染色結(jié)果（圖6A-C）。通過對(duì)不同時(shí)間段的成骨基因表達(dá)進(jìn)行檢測也發(fā)現(xiàn)30α/β-TCP@10TP-Mg 組支架具有穩(wěn)定的促成骨效應(yīng)（圖6D）。這可能是因?yàn)門CP無機(jī)鹽支架的Ca2+與TP-Mg納米粒子中的Mg2+的協(xié)同作用。   

圖7 復(fù)合支架的體外調(diào)控巨噬細(xì)胞極化性能

感染性骨缺損往往伴隨著較強(qiáng)的炎性環(huán)境，作者通過用脂多糖（LPS）刺激巨噬細(xì)胞向M1極化后，通過與復(fù)合支架共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，支架釋放的TP-Mg有效的降低了M1標(biāo)志物CD86和INOS的表達(dá)以及促進(jìn)M2標(biāo)志物CD206表達(dá)（圖7C-D）。通過PCR與Western blot蛋白分析同樣觀察到用30α/β-TCP@10TP-Mg組處理后INOS表達(dá)的下調(diào)和精氨酸酶-1（ARG-1）表達(dá)的上調(diào)（圖7E-F）。  

圖8 復(fù)合支架的體外抗菌性能

為了解決對(duì)感染性骨缺損中細(xì)菌的有效殺滅，作者通過細(xì)菌活/死圖像以及掃描電鏡下支架細(xì)菌共培養(yǎng)驗(yàn)證了TP-Mg對(duì)金黃色葡萄球菌的有效抑制（圖8A-B）隨后通過測量培養(yǎng)后的OD600和ROS水平來檢查細(xì)菌增殖（圖8D，E），結(jié)果表明，與30α/β-TCP@10TP-Mg和30α/β-TCP@50TP-Mg共培養(yǎng)后，金黃色葡萄球菌的生長受到限制，ROS產(chǎn)量顯著增加。   

總之，作者從臨床角度闡述感染性骨缺損的特點(diǎn)和當(dāng)前存在的問題。我們利用低溫3D打印技術(shù)制備了一種能夠?yàn)楣侨睋p提供足夠機(jī)械強(qiáng)度和骨傳導(dǎo)性能的仿生骨陶瓷支架。此外，我們通過負(fù)載TP和Mg自組裝納米顆粒構(gòu)建了具有抗炎、抗菌和骨誘導(dǎo)性能的α/β-TCP@TP-Mg復(fù)合陶瓷支架。研究結(jié)果表明，α/β-TCP@TP-Mg復(fù)合支架具有良好的生物相容性、優(yōu)良的成骨能力以及抗炎、抗菌活性。在大鼠感染性骨缺損模型中也顯示出有前景的修復(fù)作用。該新型醫(yī)療產(chǎn)品有可能實(shí)現(xiàn)感染性骨缺損的精準(zhǔn)治療，而無需二次手術(shù)或過度使用抗生素，從而為感染性骨缺損治療的探索提供更豐富的研究內(nèi)容。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/smll.202403681