皮膚再生重磅研究再登Science子刊！多細胞生物打印類人體皮膚加速皮膚損傷恢復(fù)

來源： EngineeringForLife

生物打印是構(gòu)建類皮膚組織的一種很有前景的方法，因為它可以在體外將皮膚的組織結(jié)構(gòu)復(fù)制到生物仿真層中。近日，來自美國維克森林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所的Anthony Atala和Adam M. Jorgensen教授團隊進行了多細胞生物打印體內(nèi)構(gòu)建類皮膚組織結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究。研究成果以“Multicellular bioprinted skin facilitates human-like skin architecture in vivo”為題于10月04日發(fā)表在《Science Translational Medicine》上。

本文使用了六種原代人類皮膚細胞進行生物打印，模擬由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成的三層皮膚結(jié)構(gòu)。將該生物打印皮膚移植到小鼠全層皮膚損傷切口上，可促進血管快速生成，并形成與人類表皮類似的結(jié)構(gòu)，同時形成外觀正常的細胞外基質(zhì)。細胞特異性染色證實植入細胞與再生皮膚完全整合。采用類似的方法，在豬皮膚損傷模型中將5cmx5cm的生物打印自體豬皮膚移植到傷口上。結(jié)果顯示生物打印皮膚移植物改善了上皮化，減少了皮膚收縮，促進正常膠原組織再生，減少纖維化。差異基因表達分析表明，在移植生物打印自體皮膚移植物的傷口中，蛋白酶可促進傷口微環(huán)境的重塑。以上結(jié)果表明，生物打印類皮膚組織可促進損傷處皮膚再生，實現(xiàn)非纖維化傷口愈合。該皮膚生物打印技術(shù)未來可進一步用于臨床研究。

本文從以下幾個方面進行詳細描述

1. 含有六種原代人類皮膚細胞的生物打印類皮膚組織在體外保持三層結(jié)構(gòu)并發(fā)育成熟

2. 生物打印類皮膚組織通過形成表皮屏障加速小鼠傷口閉合，促進細胞外基質(zhì)重塑

3. 生物打印類皮膚組織通過形成嵌合微毛細血管促進皮膚新生血管形成

4. 生物打印類皮膚組織與再生皮膚融為一體

5. 生物打印自體皮膚組織與豬全層皮膚損傷傷口整合，上皮化增加，皮膚傷口收縮減少

6. 自體生物打印皮膚組織促進皮膚表皮和真皮層修復(fù)，并調(diào)節(jié)豬皮膚傷口中ECM重塑基因表達

圖1 生物打印類人體皮膚組織流程及體外成熟

利用擠壓式生物打印技術(shù)，使用人體表皮角質(zhì)細胞、黑色素細胞、真皮成纖維細胞、FDPCs、真皮微血管ECs（DMECs）和脂肪細胞構(gòu)建生物仿真多層皮膚結(jié)構(gòu)。具體如下，細胞懸浮在三種基于纖維蛋白原的水凝膠生物墨水中，通過逐層打印形成一個3cmx3cm的三層生物仿真皮膚結(jié)構(gòu)，該構(gòu)建體由表皮、真皮和皮下組織組成。細胞具有正常表型，體外第7天，生物打印類皮膚組織中細胞存活率保持不變（存活細胞為77.7%±10.9），第13天和第21天，細胞存活率有所下降（存活細胞分別為58.2%±17.6和62.0%±36.9）。細胞存活率的降低與皮膚的特定區(qū)域有關(guān)，真皮下、真皮和表皮基底區(qū)域的細胞存活率增加，而真皮表層區(qū)域的細胞存活率降低。這種區(qū)域性細胞死亡稱為粟�；�，表現(xiàn)為從18.5±3.6%（第7天）、58.5±3.9%（第13天）和70.9±10.1%（第22天）的逐漸增加。該區(qū)域還與泛細胞角蛋白免疫熒光染色陽性相關(guān)。在體外培養(yǎng)56天后，生物打印類皮膚組織上出現(xiàn)色素沉著區(qū)域。經(jīng)過56天的體外成熟。表皮由角質(zhì)細胞（紫色）和黑色素細胞（綠色）組成，真皮由真皮成纖維細胞（橙色）和FDPCs（紅色）組成，下表皮由脂肪細胞（綠色）組成。

圖2 生物打印類皮膚組織可加速傷口閉合，改善表皮屏障，促進ECM重塑

生物打印類皮膚組織體外培養(yǎng)4天后，移植到小鼠2.5cmx2.5cm全層皮膚損傷傷口中，跟蹤觀察90天。結(jié)果示：對照組包括純生物打印凝膠組和未經(jīng)處理組。數(shù)字圖像和平面測量法用于監(jiān)測傷口完全閉合、收縮和上皮化，早期上皮化情況有所改善。到第14天所有經(jīng)生物打印類皮膚組織處理的傷口都實現(xiàn)完全閉合（分別為100±0.0%對64.1±5.0%、64.8±13.9%）。在整個愈合過程中，三組都表現(xiàn)出收縮，組間無顯著差異，傷口閉合時間的差異是由于生物打印類皮膚組織處理傷口上皮化較早所致。第21天進行血紅素、H&E和Masson染色證實生物打印類皮膚組織處理的傷口完全閉合。這些傷口具有上皮屏障，而對照組傷口覆蓋稀疏，上皮化不完全。經(jīng)生物打印類皮膚組織處理的傷口在第90天時形成類似人類的嵴線，而對照組表皮薄而平整，與正常小鼠皮膚情況一致。ECM重塑對正常愈合和纖維化愈合均至關(guān)重要。利用染色法確定再生皮膚傷口ECM結(jié)構(gòu)，到第90天時可發(fā)現(xiàn)膠原纖維成束。使用生物打印類皮膚組織處理的傷口具有與人類皮膚最相似的纖維組織。相比之下，僅使用凝膠和未處理的傷口在第42天和第90天橙色以及紅色染色增加，纖維方向平行，纖維厚度增加。定量測定膠原纖維排列系數(shù)，結(jié)果表明，生物打印類皮膚組織的膠原纖維排列系數(shù)逐漸減少，到第90天時，其排列與正常人類皮膚沒有明顯差異，與水凝膠和未處理對照組形成鮮明對比。膠原蛋白I和膠原蛋白III免疫熒光染色表明，經(jīng)生物打印類皮膚組織處理傷口主要表現(xiàn)為膠原蛋白I陽性（綠色），并有一些較細的膠原蛋白III（紅色）纖維染色，與正常人體皮膚相似。

圖3 免疫熒光染色和RT-PCR證實，移植生物打印類皮膚組織的傷口體內(nèi)90天后存在人類細胞

早期新生血管對愈合真皮的發(fā)育至關(guān)重要，可以為傷口長期恢復(fù)提供必要養(yǎng)分。生物打印類皮膚組織免疫熒光顯示血管腔內(nèi)層為CD31陽性的人類ECs（綠色），外層為CD146陽性的周細胞（紅色），表明植入的人類ECs參與再生皮膚中新生血管帽的形成，并通過招募宿主周細胞而成熟。另外，小鼠皮膚、水凝膠和未處理傷口組都只顯示少量CD146陽性的周細胞，而沒有人CD31陽性細胞。用CD146對毛細血管進行免疫染色和H&E染色來量化90天內(nèi)愈合傷口的血管再生情況。生物打印類皮膚組織處理傷口的血管密度明顯高于水凝膠和未處理組（24.7±3.8、17.8±3.0、13.7±3.4），與水凝膠和未處理組相比，生物打印類皮膚組織處理傷口由更多小型（<500μm）和中型（500至1000μm）毛細血管組成。第42天時也具有類似趨勢，到第90天時，所有組血管大小分布和密度都趨于正常。

圖4 生物打印自體皮膚移植物促進豬皮膚傷口的非收縮性閉合

接著研究人員將該技術(shù)放大到豬皮膚損傷模型中進行進一步研究，為臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。從皮膚中提取自體豬角質(zhì)細胞、成纖維細胞、EC和前脂肪細胞，并在體外擴增28天。同時培養(yǎng)異體皮膚細胞。雖然從皮膚組織中成功獲得細胞并進行擴增，但在不同治療組和動物中，所有類型細胞的成功分離和培養(yǎng)并不一致。平均而言，在細胞濃度為每毫升生物墨水10×106個細胞的情況下，產(chǎn)生的細胞數(shù)量足以打印類皮膚組織。在28天內(nèi)，平均有53.4×106個角質(zhì)細胞、69.5×106個成纖維細胞、15.3×106個ECs和51.85×106個脂肪細胞。細胞包裹在以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的生物墨水中，生物打印出6cmx6cm的類皮膚組織。移植到5cmx5cm的全層皮膚損傷傷口上，對豬身上八個傷口位置進行隨機處理，以確定特定部位愈合的差異。雖然第28天時所有組傷口都完全閉合，但生物打印類皮膚組織處理組是通過上皮化而不是收縮實現(xiàn)的閉合。具體來說，生物打印類皮膚組織移植的傷口閉合是通過上皮化（60.4±17.1%）完成的，而生物打印凝膠移植（44.4±10.8%）和僅水凝膠（35.0±8.4%）的傷口閉合則是通過收縮完成的，與生物打印自體移植物（35.8±10.3%）相比，生物打印同種異體移植物（48.9±6.0%）和純水凝膠對照組（59.0±4.8%）的收縮明顯較小。這些差異可能是由于對異體移植的免疫排斥造成的。

總結(jié)與展望
總之，含有多種人類皮膚細胞類型的生物打印類皮膚組織能促進小鼠全層皮膚損傷傷口愈合。生物打印豬皮膚自體移植通過再表皮化和減少皮膚收縮，加速傷口愈合。這一愈合過程導(dǎo)致非纖維化膠原重塑。以上研究結(jié)果表明，細胞化類皮膚組織移植物可加速傷口愈合，自體細胞進一步促進非纖維化表皮和真皮再生。生物打印自體類皮膚組織能迅速融入傷口，加速皮膚再生。皮膚生物打印技術(shù)未來可進一步用于人類皮膚損傷的治療，加速臨床轉(zhuǎn)化的進展。

文章來源：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.adf7547