皮膚再生重磅研究再登Science子刊！多細(xì)胞生物打印類(lèi)人體皮膚加速皮膚損傷恢復(fù)

來(lái)源： EngineeringForLife

生物打印是構(gòu)建類(lèi)皮膚組織的一種很有前景的方法，因?yàn)樗�可以在體外將皮膚的組織結(jié)構(gòu)復(fù)制到生物仿真層中。近日，來(lái)自美國(guó)維克森林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所的Anthony Atala和Adam M. Jorgensen教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了多細(xì)胞生物打印體內(nèi)構(gòu)建類(lèi)皮膚組織結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究。研究成果以“Multicellular bioprinted skin facilitates human-like skin architecture in vivo”為題于10月04日發(fā)表在《Science Translational Medicine》上。

本文使用了六種原代人類(lèi)皮膚細(xì)胞進(jìn)行生物打印，模擬由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成的三層皮膚結(jié)構(gòu)。將該生物打印皮膚移植到小鼠全層皮膚損傷切口上，可促進(jìn)血管快速生成，并形成與人類(lèi)表皮類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，同時(shí)形成外觀正常的細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞特異性染色證實(shí)植入細(xì)胞與再生皮膚完全整合。采用類(lèi)似的方法，在豬皮膚損傷模型中將5cmx5cm的生物打印自體豬皮膚移植到傷口上。結(jié)果顯示生物打印皮膚移植物改善了上皮化，減少了皮膚收縮，促進(jìn)正常膠原組織再生，減少纖維化。差異基因表達(dá)分析表明，在移植生物打印自體皮膚移植物的傷口中，蛋白酶可促進(jìn)傷口微環(huán)境的重塑。以上結(jié)果表明，生物打印類(lèi)皮膚組織可促進(jìn)損傷處皮膚再生，實(shí)現(xiàn)非纖維化傷口愈合。該皮膚生物打印技術(shù)未來(lái)可進(jìn)一步用于臨床研究。

本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)描述

1. 含有六種原代人類(lèi)皮膚細(xì)胞的生物打印類(lèi)皮膚組織在體外保持三層結(jié)構(gòu)并發(fā)育成熟

2. 生物打印類(lèi)皮膚組織通過(guò)形成表皮屏障加速小鼠傷口閉合，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑

3. 生物打印類(lèi)皮膚組織通過(guò)形成嵌合微毛細(xì)血管促進(jìn)皮膚新生血管形成

4. 生物打印類(lèi)皮膚組織與再生皮膚融為一體

5. 生物打印自體皮膚組織與豬全層皮膚損傷傷口整合，上皮化增加，皮膚傷口收縮減少

6. 自體生物打印皮膚組織促進(jìn)皮膚表皮和真皮層修復(fù)，并調(diào)節(jié)豬皮膚傷口中ECM重塑基因表達(dá)

圖1 生物打印類(lèi)人體皮膚組織流程及體外成熟

利用擠壓式生物打印技術(shù)，使用人體表皮角質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞、FDPCs、真皮微血管ECs（DMECs）和脂肪細(xì)胞構(gòu)建生物仿真多層皮膚結(jié)構(gòu)。具體如下，細(xì)胞懸浮在三種基于纖維蛋白原的水凝膠生物墨水中，通過(guò)逐層打印形成一個(gè)3cmx3cm的三層生物仿真皮膚結(jié)構(gòu)，該構(gòu)建體由表皮、真皮和皮下組織組成。細(xì)胞具有正常表型，體外第7天，生物打印類(lèi)皮膚組織中細(xì)胞存活率保持不變（存活細(xì)胞為77.7%±10.9），第13天和第21天，細(xì)胞存活率有所下降（存活細(xì)胞分別為58.2%±17.6和62.0%±36.9）。細(xì)胞存活率的降低與皮膚的特定區(qū)域有關(guān)，真皮下、真皮和表皮基底區(qū)域的細(xì)胞存活率增加，而真皮表層區(qū)域的細(xì)胞存活率降低。這種區(qū)域性細(xì)胞死亡稱(chēng)為粟�；�，表現(xiàn)為從18.5±3.6%（第7天）、58.5±3.9%（第13天）和70.9±10.1%（第22天）的逐漸增加。該區(qū)域還與泛細(xì)胞角蛋白免疫熒光染色陽(yáng)性相關(guān)。在體外培養(yǎng)56天后，生物打印類(lèi)皮膚組織上出現(xiàn)色素沉著區(qū)域。經(jīng)過(guò)56天的體外成熟。表皮由角質(zhì)細(xì)胞（紫色）和黑色素細(xì)胞（綠色）組成，真皮由真皮成纖維細(xì)胞（橙色）和FDPCs（紅色）組成，下表皮由脂肪細(xì)胞（綠色）組成。

圖2 生物打印類(lèi)皮膚組織可加速傷口閉合，改善表皮屏障，促進(jìn)ECM重塑

生物打印類(lèi)皮膚組織體外培養(yǎng)4天后，移植到小鼠2.5cmx2.5cm全層皮膚損傷傷口中，跟蹤觀察90天。結(jié)果示：對(duì)照組包括純生物打印凝膠組和未經(jīng)處理組。數(shù)字圖像和平面測(cè)量法用于監(jiān)測(cè)傷口完全閉合、收縮和上皮化，早期上皮化情況有所改善。到第14天所有經(jīng)生物打印類(lèi)皮膚組織處理的傷口都實(shí)現(xiàn)完全閉合（分別為100±0.0%對(duì)64.1±5.0%、64.8±13.9%）。在整個(gè)愈合過(guò)程中，三組都表現(xiàn)出收縮，組間無(wú)顯著差異，傷口閉合時(shí)間的差異是由于生物打印類(lèi)皮膚組織處理傷口上皮化較早所致。第21天進(jìn)行血紅素、H&E和Masson染色證實(shí)生物打印類(lèi)皮膚組織處理的傷口完全閉合。這些傷口具有上皮屏障，而對(duì)照組傷口覆蓋稀疏，上皮化不完全。經(jīng)生物打印類(lèi)皮膚組織處理的傷口在第90天時(shí)形成類(lèi)似人類(lèi)的嵴線，而對(duì)照組表皮薄而平整，與正常小鼠皮膚情況一致。ECM重塑對(duì)正常愈合和纖維化愈合均至關(guān)重要。利用染色法確定再生皮膚傷口ECM結(jié)構(gòu)，到第90天時(shí)可發(fā)現(xiàn)膠原纖維成束。使用生物打印類(lèi)皮膚組織處理的傷口具有與人類(lèi)皮膚最相似的纖維組織。相比之下，僅使用凝膠和未處理的傷口在第42天和第90天橙色以及紅色染色增加，纖維方向平行，纖維厚度增加。定量測(cè)定膠原纖維排列系數(shù)，結(jié)果表明，生物打印類(lèi)皮膚組織的膠原纖維排列系數(shù)逐漸減少，到第90天時(shí)，其排列與正常人類(lèi)皮膚沒(méi)有明顯差異，與水凝膠和未處理對(duì)照組形成鮮明對(duì)比。膠原蛋白I和膠原蛋白III免疫熒光染色表明，經(jīng)生物打印類(lèi)皮膚組織處理傷口主要表現(xiàn)為膠原蛋白I陽(yáng)性（綠色），并有一些較細(xì)的膠原蛋白III（紅色）纖維染色，與正常人體皮膚相似。

圖3 免疫熒光染色和RT-PCR證實(shí)，移植生物打印類(lèi)皮膚組織的傷口體內(nèi)90天后存在人類(lèi)細(xì)胞

早期新生血管對(duì)愈合真皮的發(fā)育至關(guān)重要，可以為傷口長(zhǎng)期恢復(fù)提供必要養(yǎng)分。生物打印類(lèi)皮膚組織免疫熒光顯示血管腔內(nèi)層為CD31陽(yáng)性的人類(lèi)ECs（綠色），外層為CD146陽(yáng)性的周細(xì)胞（紅色），表明植入的人類(lèi)ECs參與再生皮膚中新生血管帽的形成，并通過(guò)招募宿主周細(xì)胞而成熟。另外，小鼠皮膚、水凝膠和未處理傷口組都只顯示少量CD146陽(yáng)性的周細(xì)胞，而沒(méi)有人CD31陽(yáng)性細(xì)胞。用CD146對(duì)毛細(xì)血管進(jìn)行免疫染色和H&E染色來(lái)量化90天內(nèi)愈合傷口的血管再生情況。生物打印類(lèi)皮膚組織處理傷口的血管密度明顯高于水凝膠和未處理組（24.7±3.8、17.8±3.0、13.7±3.4），與水凝膠和未處理組相比，生物打印類(lèi)皮膚組織處理傷口由更多小型（<500μm）和中型（500至1000μm）毛細(xì)血管組成。第42天時(shí)也具有類(lèi)似趨勢(shì)，到第90天時(shí)，所有組血管大小分布和密度都趨于正常。

圖4 生物打印自體皮膚移植物促進(jìn)豬皮膚傷口的非收縮性閉合

接著研究人員將該技術(shù)放大到豬皮膚損傷模型中進(jìn)行進(jìn)一步研究，為臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。從皮膚中提取自體豬角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、EC和前脂肪細(xì)胞，并在體外擴(kuò)增28天。同時(shí)培養(yǎng)異體皮膚細(xì)胞。雖然從皮膚組織中成功獲得細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，但在不同治療組和動(dòng)物中，所有類(lèi)型細(xì)胞的成功分離和培養(yǎng)并不一致。平均而言，在細(xì)胞濃度為每毫升生物墨水10×106個(gè)細(xì)胞的情況下，產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)量足以打印類(lèi)皮膚組織。在28天內(nèi)，平均有53.4×106個(gè)角質(zhì)細(xì)胞、69.5×106個(gè)成纖維細(xì)胞、15.3×106個(gè)ECs和51.85×106個(gè)脂肪細(xì)胞。細(xì)胞包裹在以纖維蛋白原為基礎(chǔ)的生物墨水中，生物打印出6cmx6cm的類(lèi)皮膚組織。移植到5cmx5cm的全層皮膚損傷傷口上，對(duì)豬身上八個(gè)傷口位置進(jìn)行隨機(jī)處理，以確定特定部位愈合的差異。雖然第28天時(shí)所有組傷口都完全閉合，但生物打印類(lèi)皮膚組織處理組是通過(guò)上皮化而不是收縮實(shí)現(xiàn)的閉合。具體來(lái)說(shuō)，生物打印類(lèi)皮膚組織移植的傷口閉合是通過(guò)上皮化（60.4±17.1%）完成的，而生物打印凝膠移植（44.4±10.8%）和僅水凝膠（35.0±8.4%）的傷口閉合則是通過(guò)收縮完成的，與生物打印自體移植物（35.8±10.3%）相比，生物打印同種異體移植物（48.9±6.0%）和純水凝膠對(duì)照組（59.0±4.8%）的收縮明顯較小。這些差異可能是由于對(duì)異體移植的免疫排斥造成的。

總結(jié)與展望
總之，含有多種人類(lèi)皮膚細(xì)胞類(lèi)型的生物打印類(lèi)皮膚組織能促進(jìn)小鼠全層皮膚損傷傷口愈合。生物打印豬皮膚自體移植通過(guò)再表皮化和減少皮膚收縮，加速傷口愈合。這一愈合過(guò)程導(dǎo)致非纖維化膠原重塑。以上研究結(jié)果表明，細(xì)胞化類(lèi)皮膚組織移植物可加速傷口愈合，自體細(xì)胞進(jìn)一步促進(jìn)非纖維化表皮和真皮再生。生物打印自體類(lèi)皮膚組織能迅速融入傷口，加速皮膚再生。皮膚生物打印技術(shù)未來(lái)可進(jìn)一步用于人類(lèi)皮膚損傷的治療，加速臨床轉(zhuǎn)化的進(jìn)展。

文章來(lái)源：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.adf7547