研究人員突破管狀支架替代品制備新工藝，基于可控四軸擠出式熔紡增材制造系統(tǒng)

導讀：在人體器官中，許多管狀組織（如血管和氣管）可能會因創(chuàng)傷和疾病而遭受長節(jié)段性缺陷。由于目前自體移植物的使用受到限制，對合成替代品作為可能的替代方案的需求一直受到關(guān)注。這些管狀器官的制造通常通過靜電紡絲和使用旋轉(zhuǎn)收集器的熔體電潤濕等技術(shù)來完成。

2023年8月14日，南極熊獲悉，來自馬斯特里赫特大學 MERLN 技術(shù)啟發(fā)再生醫(yī)學研究所的研究人員開發(fā)了一種名為“熔體紡絲（Melt-spinning）“的新方法，它是基于旋轉(zhuǎn) 4 軸擠出式的增材制造系統(tǒng)，可能會更加高效。

目前的增材制造（AM）系統(tǒng)通常不使用旋轉(zhuǎn)軸，這限制了它們在管狀支架制造中的應用。在馬斯特里赫特大學復雜組織再生學院和布加勒斯特理工大學先進高分子材料小組的一項新研究中，研究人員開發(fā)了這種基于四軸擠出的增材制造系統(tǒng)，類似于融合技術(shù)沉積建模（FDM）已被開發(fā)用于創(chuàng)建管狀空心支架，他們把新的增材制造工藝稱為“熔紡”。這項研究以題為“基于可控四軸擠壓的增材制造系統(tǒng)，用于制造具有可定制機械性能的管狀支架/Controllable four axis extrusion-based additive manufacturingsystem for the fabrication of tubular scaffolds with tailorable mechanicalproperties”的論文被發(fā)表在《Materials Science and Engineering: C》期刊上，由Kenny A. van Kampen a, Elena Olaret等人聯(lián)合撰寫。

相關(guān)論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0928493120333907

項目進一步研究了矩形和金剛石孔結(jié)構(gòu)設計的機械特性，分別作為標準和仿生孔幾何形狀。三點彎曲分析表明，與矩形設計相比，金剛石孔設計更能抵抗管腔塌陷。該數(shù)據(jù)表明，通過改變支架孔隙設計，可以獲得廣泛的機械性能。此外，通過開發(fā)的 4 軸擠壓系統(tǒng)可以實現(xiàn)對支架設計和幾何形狀的完全控制，這在其他技術(shù)中尚未有報道。這種靈活性允許通過設計合適的沉積模式來匹配其機械先決條件，從而制造用于各種管狀組織再生應用的支架。

增材制造技術(shù)，例如熔融沉積建模 (FDM)、生物繪圖和其他基于擠出的技術(shù)，適合通過制造數(shù)百微米的纖維來提高支架的機械完整性。使用當前基于擠壓的設置創(chuàng)建管狀結(jié)構(gòu)的主要限制是可以制造的設計和幾何形狀，因為對于這些懸垂和空心結(jié)構(gòu)需要支撐材料。這種限制主要是由于大多數(shù)系統(tǒng)使用逐層制造方法，通過隨后沉積纖維來形成對象輪廓內(nèi)每層的填充，并且重復此過程直到獲得完整的 3D 對象。這種沉積通常發(fā)生在相對于打印頭沿 XY 平面和 Z 方向移動的平坦基材上。

熔體紡絲中第四軸的實施允許創(chuàng)建更復雜的管狀支架設計，正如假體植入物領(lǐng)域中所描述的那樣。其他團隊已在其用于生物醫(yī)學應用的 FDM 系統(tǒng)中實現(xiàn)了第四軸，但往往缺乏旋轉(zhuǎn)軸和主系統(tǒng)之間的通信，導致僅創(chuàng)建螺旋設計。除此之外，管狀支架通常不能完全表征其機械性能和軸向、徑向和彎曲變形的行為。

MERLN 這項研究的目的是展示一種類似于 FDM 的基于擠出的增材制造技術(shù)，具有同步的第四旋轉(zhuǎn)軸，可以制造復雜的管狀幾何形狀。此外，他們還進一步研究了幾何形狀在支架設計中的作用及其對徑向壓縮、拉伸強度和三點彎曲等力學性能的影響。

彎曲旋轉(zhuǎn)制作肌細胞

在后續(xù)研究中，MERLN 研究人員使用相同的熔紡技術(shù)來制造具有可定制纖維參數(shù)的模擬血管移植物。熔融紡絲可以通過熔化聚合物并將其直接沉積在紡絲芯軸上，在芯軸周圍產(chǎn)生細纖維，而無需電場。所得纖維高度排列且可重復，纖維尺寸變化很小。該技術(shù)的最新進展導致制造出具有增強機械性能的核殼纖維。

無需電場，制造過程的可控和不可控參數(shù)不再是限制。因此，可以將其總結(jié)為簡化的方程，以根據(jù)纖維尺寸、纖維角度和所得間距來預測纖維參數(shù)。這可能會產(chǎn)生更具可重復性的阻擋層。與 SES 非常相似，這些微纖維需要機械支撐�；�于四軸熔體擠出的系統(tǒng)可以通過在較小的微纖維周圍形成較大的粗纖維來提供這種支撐。

第二項 MERLN 研究的目的是進一步開發(fā)旋轉(zhuǎn)技術(shù)，該技術(shù)能夠在小直徑血管移植物中排列平滑肌細胞。此外，根據(jù)獲得的結(jié)果制定了簡化的數(shù)學方程來預測纖維直徑、纖維之間的距離和沉積角度。在支架上培養(yǎng)原代平滑肌細胞，以評估細胞是否在形態(tài)上模仿動脈中膜。最后，與內(nèi)皮細胞進行共培養(yǎng)，以評估排列的原代平滑肌細胞是否影響內(nèi)皮細胞的形態(tài)。

平滑肌細胞在維持血壓和細胞外基質(zhì)重塑方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這些細胞具有特征性的紡錘形狀，并沿徑向排列，以幫助收縮任何動脈。組織工程移植物有可能重建這種排列，并為不可吸收或自體移植物提供可行的替代方案。具體來說，通過熔紡可以制造出可以在支架上沿圓周排列的小直徑纖維。在本研究中，制定了一組簡化方程來預測最終的纖維參數(shù)。

在制造的支架上監(jiān)測平滑肌細胞的排列狀態(tài)。最后，對平滑肌細胞與內(nèi)皮細胞直接接觸進行共培養(yǎng)，以評估平滑肌細胞排列對內(nèi)皮細胞形態(tài)的影響。結(jié)果表明，該方程能夠準確預測纖維直徑、距離和角度。原代血管平滑肌細胞根據(jù)模擬天然方向的纖維方向排列。與內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)表明，排列的平滑肌細胞對內(nèi)皮細胞的形態(tài)沒有影響。總之，我們制定了一系列方程，可以預測熔融紡絲過程中的纖維參數(shù)。此外，這里描述的方法可以創(chuàng)建一個具有環(huán)周排列的平滑肌細胞的血管移植物，其形態(tài)與天然血管取向相似。

熔體紡絲的機械強度

在另一項發(fā)表在《ACS Biomater. Sci. Eng.》期刊上、論文題為“Flexible, Suturable, and Leak-free Scaffolds for Vascular TissueEngineering Using Melt Spinning “的研究中， MERLN 研究人員通過描述具有不同纖維排列的管狀支架的制造來展示血管移植物的進一步優(yōu)化，這些支架具有強大的機械性能、無泄漏且可縫合。

相關(guān)論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsbiomaterials.3c00535

科學家們還研究了這些特性對 hMSC 分化為 SMC 樣細胞的細胞行為的影響。還接種內(nèi)皮細胞以獲得包含動脈內(nèi)膜和中層的構(gòu)建體。

△打印頭速度對支架纖維結(jié)構(gòu)的影響。(A) 示意圖顯示了用于量化纖維之間角度的程序。(B) 所生產(chǎn)的支架的掃描電子顯微鏡圖像。(C) SEM 圖像中纖維之間角度的量化（n = 15–25，**** p ≤ 0.0001）。

MERLN 的熔紡制造方法可以對圓周方向的纖維取向進行精細控制（如上圖所示）。纖維之間的角度通過 SEM 獲得的圖像進行量化。當打印頭以 1 mm/s 的速度移動時，纖維彼此平行沉積（0 角）。速度為10mm/s時，兩根纖維之間的夾角為10.4±1.0°；速度20mm/s時，纖維角度為19.3±2.5°；速度為30mm/s時，纖維角度為33.6±5.8°。纖維直徑為31.6±3.9μm，不受打印頭速度的影響。纖維直徑也可以通過改變收集器的轉(zhuǎn)速來改變。在最終的 MERLN 研究中，該參數(shù)保持恒定在 1060 rpm。為了進一步測試，選擇了三種纖維取向（0、19和33°），為了更容易地標記，稱之為1、20和30°。

△三點彎曲試驗。(A) 開始時、20% 應變、160% 應變和測試后的宏觀成像。(B) 力-位移測量的斜率值。(C) 力-位移測量的最大力值。兩種灰色陰影表示兩個獨立的實驗，最小 n = 4（總計 n = 10）（** p ≤ 0.01，*** p ≤ 0.001，nd = 未確定）。

進行三點彎曲測試以評估所生產(chǎn)的支架的機械性能（參見上圖）。1° 支架表現(xiàn)出脆性行為，因為它們在 10% 應變下已經(jīng)斷裂。20° 支架更加堅固，在高達 60% 應變的情況下沒有顯示出可見缺陷，但此后開始出現(xiàn)清晰的纖維開口。30° 支架在最高測試應變 160% 下沒有可見缺陷。20° 和30° 支架可彎曲高達 160% 應變（最大測試值），而不會扭結(jié)或支架斷裂。

為了測試支架容納液體的能力，在支架的每一端引入魯爾鎖倒刺塞，并將其連接到安裝在注射泵上的注射器（如下圖所示）。含有藍色食用色素的水或含有紅色色素的 5% BSA PBS 溶液流過支架。含有 BSA 的溶液被用作血液的“替代品”。在任何測試流速（1.2、10.2 和 25 mL/min）下均未觀察到泄漏。盡管支架能夠容納液體，但它們呈現(xiàn)出高孔隙率（補充圖3）。值得注意的是，泄漏實驗中測試的支架之前曾用于三點彎曲測試，表明施加的高應變并未對支架產(chǎn)生負面影響。

△(A) 以 25 mL/min 運行的泄漏測試的特寫。(B) 使用連續(xù)縫合線 (6-0 Prolene) 將支架縫合到豬頸動脈上。