清華大學熊卓團隊：3D打印具有高細胞密度和異質微環(huán)境的血管化肝組織

來源：EngineeringForLife

3D擠出生物打印由于其精確沉積細胞和生物相容性材料（即生物墨水）的強大能力，已廣泛應用于組織工程和再生醫(yī)學。理想的生物墨水應具有良好的可打印性，以產生組織形狀的結構，同時屏蔽封裝細胞在生物打印過程中免受有害暴露。然而，目前仍然缺乏具有高細胞密度和可打印性的生物墨水極大地限制了打印功能組織的能力。

針對此問題，來自清華大學的熊卓課題組開發(fā)了一種基于密集細胞聚集體的顆粒細胞聚集體雙相（GCAB）生物墨水來解決這一限制。GCAB生物墨水表現出擠出生物打印所需的剪切稀化和剪切恢復特性以及打印后的超彈性行為，用于模擬軟生物組織的機械特性（圖1）。通過在定義的異質微環(huán)境中預組織GCAB生物墨水，打印出具有增強血管化和代謝功能的致密肝組織結構（圖1）。這種通用GCAB生物墨水的設計為創(chuàng)建用于治療應用的功能組織開辟了新途徑。

相關論文以“3D printing of vascularized hepatic tissues with a high cell density and heterogeneous microenvironment”為題于2023年7月20日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 GCAB生物墨水示意圖

1. 具有生理密度的通用生物墨水
為了在生物3D打印中用作生物鏈接，需要大量產生大小和形狀一致的細胞聚集體。在這項研究中，作者使用HepG2球體作為樣本，因為HepG2是一種癌細胞系，已被廣泛用作研究肝功能的模型細胞。為此，使用由10000個微孔組成的PDMS微孔板以高通量產生球狀體（圖2a-b）。HepG2球體在24小時內自組裝，這是因為細胞間相互作用明顯高于細胞-基質相互作用（圖2c-e）。活/死分析證實大多數HepG2球狀體仍然為存活狀態(tài)（圖2f）。

然后，作者通過在GelMA水凝膠內密集堆積GFP-HepG2球體來制備GCAB生物墨水。GFP-HepG2球體用于可視化它們在打印絲內的密集分布（圖2i）。作者還成功打印了清華大學的標志“THU”（圖2j），通過將打印的結構分解成單個細胞，將細胞密度量化為~1.7×108個細胞，同時在第7天觀察到細胞遷移和球體融合（即多個球體的直接聚集）。SEM圖像證實了GCAB生物墨水的蜂窩狀結構，其中球體緊密堆積并被周圍的水凝膠基質分隔開（圖2k）。同樣，作者生成了直徑為115±10 μm、圓度為0.87±0.04的人類間充質干細胞(MSC)球體（圖2l）。

圖2 開發(fā)顆粒狀聚集體作為具有生理密度的通用生物墨水

2. GCAB生物墨水的3D打印和機械表征
生物墨水的流變特性對于擠出生物打印至關重要。為了評估聚集體形態(tài)對流變特性的影響，作者將GCAB生物墨水與傳統(tǒng)的無細胞(CF)和DCL GelMA水凝膠生物墨水的流變特性進行了比較。所有生物墨水都顯示出必要的剪切稀化（圖3a）、屈服應力（圖3b）和自我修復（圖3c）特性，并具有快速愈合動態(tài)打印后，從而保護細胞免受高剪力墻應力，同時保持結構穩(wěn)定性。GCAB生物墨水由于其堵塞性質而變得不太對溫度敏感（圖3d），這表明擠出生物打印的溫度窗口延長。隨后，作者優(yōu)化了打印參數，成功打印了高保真雙環(huán)（圖3e）和晶格結構（圖3f），表達GFP的球體用于確認GCAB生物墨水的顆粒形態(tài)和相鄰層之間的互連性。GCAB生物墨水表現出與傳統(tǒng)DCL生物墨水相當的印刷適性（圖3g）。

圖3 GCAB生物墨水的3D打印和機械表征

擠出和自由基聚合過程中的剪切力對細胞活力產生負面影響。存活的球體在培養(yǎng)過程中繼續(xù)生長（圖3k）。GCAB生物墨水表現出比DCL生物墨水更快的增殖速率（圖3l）。此外，使用GCAB墨水打印的結構可以承受約50%的應變并彈性恢復數百次，從而驗證了其出色的循環(huán)壓縮性能（圖3o）。

3. 異質微環(huán)境增強血管化和肝功能
基于以上結果，作者使用GCAB生物墨水創(chuàng)建高細胞密度的器官特異性組織。通過結合懸浮浴將GCAB生物墨水打印到人體解剖結構中。作者成功打印了肝臟模型（圖4b）、螺旋圖案（圖4c）和包含懸垂物和空腔的開放室（圖4d）。打印結構和3D模型的配準證實了高形狀保真度。接著，作者通過將HUVEC納入GCAB生物墨水的水凝膠相來重現肝臟致密且異質的細胞微環(huán)境。GCAB生物墨水組中的GFPHUVEC主要局限于球狀體間區(qū)域（圖4e-f），而DCL生物墨水組中的HUVEC與RFPHepG2細胞均勻混合（圖4g-h）。

在水凝膠的血管形態(tài)發(fā)生過程中，封裝的HUVEC通過整合素與基質相互作用，形成空隙空間（即液泡），這些空隙空間在細胞內和細胞間結合形成管腔。一些較大的液泡已經合并，在細胞內形成大型的管腔結構。毛細管狀結構可以維持至少7天（圖4i-j）。VEcadherin免疫染色進一步證實了這一點，這對于內皮細胞接觸完整性至關重要（圖4m-n）。這些發(fā)現表明，GCAB生物墨水為體外細胞介導的含腔毛細血管網絡的形成提供了更寬松的環(huán)境。

圖4 異質微環(huán)境增強血管化和肝功能

4. 具有可灌注血管網絡的功能性肝組織的3D打印
在這項研究中，作者嘗試同時制造具有高細胞密度和可灌注血管網絡的3D厚組織結構。由于GCAB生物墨水太弱，無法支持包含空隙或通道的打印結構，因此打印了短效墨水作為模板來生成血管網絡，同時支持GCAB生物墨水的打�。▓D5a）。為了提高HUVEC的接種效率和均勻性，使用了原位內皮化策略，將內皮細胞封裝在犧牲明膠生物墨水內。熒光顯微鏡所示，有許多內皮細胞附著在通道表面。SEM圖像證實了GFP-HUVEC在第1天的均勻分布（圖5e），表明原位內皮化方法具有較高的接種效率。第3天（圖5f-g），細胞增殖形成匯合的內皮層。此外，還在第7天觀察到可灌注血管網絡侵入由GCAB生物墨水組成的周圍組織（圖5h-i)）。由此可見，通過將GCAB生物墨水與先進的生物打印策略相結合，可以制造具有接近生理細胞密度、脈管系統(tǒng)和功能的個性化器官特異性組織，用于治療目的。

圖5 具有可灌注血管網絡的功能性肝組織的3D打印

綜上，本文引入了基于顆粒細胞聚集體的雙相（GCAB）生物墨水的概念，作為擴展擠出生物打印生物墨水庫的通用策略。這種方法提供了優(yōu)良的生物打印能力，具有高細胞密度、良好的活力和超彈性行為，還打印了具有異質細胞微環(huán)境的血管化肝組織結構，由于更緊密的細胞間相互作用而加速了血管化和組織重塑。此外，通過與犧牲打印策略相結合，生產了具有可灌注血管網絡的功能性致密肝組織結構，以滿足其代謝需求。先進的生物打印策略與GCAB生物墨水的自組織特性的融合，將為創(chuàng)建用于治療應用的功能性組織和器官開辟新途徑。

文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ace5e0