基于快速應(yīng)力松弛生物墨水的工程化3D打印骨骼肌仿生支架

來源： Regenovo

嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除或肌肉消耗性疾病可能引起體內(nèi)大面積骨骼肌損失(VML)，該疾病會(huì)降低自愈能力，并導(dǎo)致肌肉功能喪失。目前，由于供體部位的局限性和功能缺陷，VML的臨床治療受到限制。組織工程技術(shù)被認(rèn)為是VML修復(fù)的潛在治療選擇。由于天然骨骼肌具有高度定向結(jié)構(gòu)，通過生物3D打印各向異性仿生支架等手段來模擬天然骨骼肌的排列結(jié)構(gòu)，并在3D環(huán)境中誘導(dǎo)細(xì)胞伸長，對于體內(nèi)肌肉損失修復(fù)至關(guān)重要。一般來說，具有明顯應(yīng)力松弛的粘彈性水凝膠可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和增殖。然而，目前用作3D生物打印的光固化生物墨水材料多為彈性水凝膠。因此開發(fā)具有快速應(yīng)力松弛的光固化水凝膠生物墨水將有利于體外工程化3D骨骼肌搭建和VML修復(fù)。近期，南方醫(yī)科大學(xué)黃文華、吳耀彬教授團(tuán)隊(duì)在Acta Biomaterialia期刊上發(fā)表了一篇題為Bioprinted anisotropic scaffolds with fast stress relaxation bioink for engineering 3D skeletal muscle and repairing volumetric muscle loss的文章。該研究以明膠甲基丙烯酰（GelMA）和纖維蛋白原（Fibrinogen）為原料，經(jīng)光交聯(lián)和酶交聯(lián)后成功制備得到了一種可調(diào)節(jié)應(yīng)力松弛的互穿網(wǎng)絡(luò)（IPN）水凝膠（FG IPN），通過凝膠內(nèi)支撐打�。╣el-in-gel）的方式，構(gòu)建了基于生物3D打印的各向異性骨骼肌三維仿生支架，并將其用于VML修復(fù)（圖1）。該研究將為骨骼肌損傷臨床治療提供新思路。

圖1基于應(yīng)力松弛FG-IPN水凝膠的3D生物打印仿生支架設(shè)計(jì)和制造示意圖

具有快速應(yīng)力松弛性能的FG IPN水凝膠的制備和表征
通過調(diào)節(jié)纖維蛋白原和GelMA的濃度比（F:G），F(xiàn)G IPN水凝膠顯示出可調(diào)的粘彈性（圖2a）。研究者通過將濃度比（濃度單位/wt%）分別設(shè)定為0:5、2.5:5、5:5，制備得到不同 FG-IPN水凝膠：GelMA、F2.5G5、F5G5（圖2b）。由圖2c可知，當(dāng)纖維蛋白原濃度增加時(shí)，由于凝血酶和氯化鈣交聯(lián)產(chǎn)生蛋白質(zhì)納米纖維，使得纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)數(shù)量增加，導(dǎo)致FG-INP水凝膠的透明度降低。同時(shí)可觀察到GelMA水凝膠在其微孔表面沒有任何納米纖維產(chǎn)生。根據(jù)SEM圖像進(jìn)一步分析了FG IPN水凝膠體系的孔隙率和網(wǎng)格密度，發(fā)現(xiàn)三組孔隙率無顯著差異（圖2d）。纖維蛋白原經(jīng)酶交聯(lián)后形成具有弱粘彈性的纖維蛋白水凝膠，纖維蛋白凝膠表現(xiàn)出快速的應(yīng)力松弛，由此加速了FG IPN 水凝膠的應(yīng)力松弛，說明FG IPN水凝膠的應(yīng)力松弛性能與連接到網(wǎng)絡(luò)的纖維蛋白纖維有關(guān)(圖2f,g)。與F2.5G5和GelMA相比，F(xiàn)5G5水凝膠的儲(chǔ)能模量略有增加但沒有顯著差異(圖2h)，這也表明GelMA與纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用對FG-IPN水凝膠的力學(xué)性能有協(xié)同作用。

圖2 不同混合比例的FG IPN水凝膠應(yīng)力松弛性能表征示意圖

FG IPN水凝膠內(nèi)的細(xì)胞擴(kuò)散、增殖和分化表征
為了探索FG IPN凝膠中的粘彈性纖維蛋白對細(xì)胞的影響，研究者以GelMA（不含纖維蛋白）作為對照組，進(jìn)一步對含不同纖維蛋白濃度的F2.5G5和F5G5 IPN水凝膠進(jìn)行了研究�；钏廊旧珗D像及細(xì)胞活性統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（圖3a-b），C2C12成肌細(xì)胞存活數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加表現(xiàn)出顯著的增長。在培養(yǎng)5天后，約有90%的細(xì)胞存活，且細(xì)胞活力沒有顯著差異。培養(yǎng)7天后，通過F-actin染色進(jìn)一步研究粘彈性水凝膠對細(xì)胞形態(tài)的影響（圖3c），與GelMA水凝膠組相比，F(xiàn)2.5G5和F5G5水凝膠組的大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出顯著的伸長。F5G5組細(xì)胞骨架面積明顯高于GelMA組和F2.5G5組（圖3d-e）。這些結(jié)果表明，應(yīng)力松弛速率在調(diào)節(jié)三維粘彈性水凝膠中的細(xì)胞擴(kuò)展和延伸中起著關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步研究水凝膠應(yīng)力松弛對成肌細(xì)胞分化的影響，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后進(jìn)行肌球蛋白重鏈（MHC）染色。免疫熒光染色圖像（圖3f）顯示，F(xiàn)5G5水凝膠內(nèi)C2C12細(xì)胞中肌管形成率和肌管長度顯著高于其他組（F2.5G5和GelMA），而且在更快的應(yīng)力松弛下的水凝膠中可以形成更多的肌管。這些結(jié)果表明，細(xì)胞通過整合素在纖維蛋白納米纖維上施加力，并且纖維蛋白的重新排列增強(qiáng)了細(xì)胞粘附的能力并使得它們可以沿著蛋白納米纖維鋪展（圖3i）。

圖3 FG IPN水凝膠中C2C12細(xì)胞的形態(tài)和分化表征結(jié)果

FG IPN水凝膠在Carbopol負(fù)載凝膠中的打印性能表征
以FG IPN水凝膠為生物墨水，通過凝膠內(nèi)支撐打印策略制造生物3D打印的仿生支架，并對FG IPN凝膠的物理性能進(jìn)行研究，以確認(rèn)打印工藝的可行性（圖4a）。FG溶液在低于15 °C下轉(zhuǎn)化為物理交聯(lián)的凝膠（圖4b-c）。預(yù)冷FG凝膠的粘度隨著剪切速率的增加而顯著降低（圖4d）。這種剪切稀化特性使得FG IPN生物墨水容易擠壓通過打印針頭。為了制備最佳的Carbopol負(fù)載凝膠，探索了三種濃度（0.2wt%，0.8wt%和1.4wt%）的Carbopol負(fù)載凝膠性能。通過透明度（圖4e）、流變性能（圖4f）以及維持打印結(jié)構(gòu)性能的表征結(jié)果，最后選用0.8wt%的Carbopol負(fù)載凝膠以保持打印支架穩(wěn)定性與良好的觀察透明度。

為了分析打印參數(shù)對Carbopol負(fù)載凝膠中的水凝膠纖維的線寬的影響（圖4g-h），對水凝膠施加不同的移動(dòng)速度（3、5、7、9和11 mm/s）和打印壓力（1.0、1.5、2.0、2.5和3.0bar）。結(jié)果表明，打印纖維的線寬隨著打印壓力的增加而增加（圖4i），而在Carbopol負(fù)載凝膠中隨著移動(dòng)速度的增加而減小。為了確認(rèn)Carbopol負(fù)載凝膠的打印可行性，在15 °C下使用應(yīng)力松弛FG IPN水凝膠在Carbopol支撐的凝膠中打印3D結(jié)構(gòu)“SMU”，看到打印的結(jié)構(gòu)保持良好而沒有任何塌陷（圖4j）。如圖4 k-l所示，研究者通過3D打印制備了仿生定向排列骨骼肌支架（支架尺寸：15 × 6 × 4mm（長×寬×高）），并在光交聯(lián)和酶交聯(lián)后，成功從Carbopol負(fù)載凝膠中取出3D支架（圖4m）。

圖4 FG IPN水凝膠在Carbopol負(fù)載凝膠中的3D打印性能表征

基于FG IPN水凝膠的生物3D打印定向排列骨骼肌體外模型
研究者利用上述所用方法在Carbopol凝膠介質(zhì)中對載有C2C12成肌細(xì)胞的FG生物墨水進(jìn)行打�。▓D5a），經(jīng)光交聯(lián)和酶交聯(lián)后，將形成的載有細(xì)胞的支架從Carbopol凝膠中順利移除用作后續(xù)研究。其中以未經(jīng)過3D打印直接形成的負(fù)載細(xì)胞的3D凝膠組作為對照組�；�/死染色圖像及細(xì)胞存活率結(jié)果顯示(圖5b-c)，生物3D打印定向排列支架組中細(xì)胞存活率約90%（與3D凝膠組內(nèi)細(xì)胞存活率一樣高）。此外，在與第1天和第3天未填充纖維的細(xì)胞相比（圖5d），培養(yǎng)5天后的C2C12成肌細(xì)胞在定向排列仿生支架內(nèi)顯示出更好的生長和伸長的形態(tài)。立體顯微鏡熒光圖像（圖5e）展示了培養(yǎng)7天后，3D支架內(nèi)的完整細(xì)胞分布。細(xì)胞骨架的面積覆蓋率在3D支架組和3D凝膠組之間沒有顯著差異（圖5f）。共聚焦圖像和細(xì)胞取向的極性分布顯示C2C12成肌細(xì)胞在3D支架中具有伸長的細(xì)胞骨架，而這在3D凝膠組中不明顯（圖5h-i）。許多肌管在3D支架中形成并伸長，表明其具有誘導(dǎo)肌管融合形成的能力（圖5j）。

圖5 生物3D打印定向排列骨骼肌體外模型性能表征

基于FG IPN水凝膠的3D生物打印支架的體內(nèi)炎癥和微血管化研究
為了研究基于FG-IPN水凝膠的無細(xì)胞3D生物打印支架用于體內(nèi)VML修復(fù)的潛力，研究者在SD大鼠背部皮下植入支架，兩周后評估其炎癥和體內(nèi)微血管形成能力。H&E染色圖像顯示，3D定向排列支架組比3D凝膠組表現(xiàn)出更低的炎癥水平（圖6a-c/e-g）。組織外觀圖像顯示（圖6a、e），在植入14天后，3D支架組中的植入?yún)^(qū)域中出現(xiàn)微血管。而3D凝膠組未顯示顯著的微血管形成。H&E染色表明(圖6d、h)在3D支架組中形成了血液微血管壁。相比之下，3D凝膠組在第14天后血管數(shù)量較少。此外，3D支架組中的毛細(xì)血管數(shù)量顯著高于3D凝膠組中的毛細(xì)血管數(shù)量(圖6j)。與3D凝膠組相比，3D定向排列支架組中毛細(xì)血管的覆蓋率顯著增強(qiáng)(圖6k)，這表明應(yīng)力松弛FG IPN水凝膠的納米纖維結(jié)構(gòu)和定向排列纖維之間的距離對于體內(nèi)血管化有一定作用。

圖6 3D生物打印骨骼肌支架植入大鼠背部14天后體內(nèi)細(xì)胞炎癥和血管生成研究

3D生物打印FG-IPN水凝膠支架誘導(dǎo)VML修復(fù)
在大鼠脛骨前肌中構(gòu)建VML缺損，然后將無細(xì)胞支架植入VML缺損中。H&E染色圖像顯示(圖7a-b)，在手術(shù)兩周后，3D支架組比其他組形成了更多的新肌纖維。圖7d結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白組和3D凝膠組纖維區(qū)周圍密度明顯增強(qiáng)，其中空白組中纖維化區(qū)域周圍的密度增強(qiáng)程度最顯著（藍(lán)色代表膠原，紅色代表肌纖維）。3D支架組中新形成的肌纖維的數(shù)量顯著高于空白組和3D凝膠組，這表明3D支架誘導(dǎo)肌纖維形成的能力較強(qiáng)(圖7a，f)。此外，3D支架組中形成的微血管比空白組和3D凝膠組中形成的微血管更多。同時(shí)定量分析也顯示（圖7g），3D支架組中的毛細(xì)血管數(shù)量高于空白組和3D凝膠組中的毛細(xì)血管數(shù)量。

圖7 植入三維排列支架2周后的大鼠模型修復(fù)瘢痕肌損傷表征

在術(shù)后6個(gè)月，進(jìn)一步研究VML修復(fù)后的大鼠功能恢復(fù)情況。使用超聲成像觀察并定量分析骨骼肌損傷的修復(fù)區(qū)域(圖8a)，發(fā)現(xiàn)不同組的橫截面積和側(cè)截面積沒有顯著差異，表明在損傷區(qū)域中肌纖維發(fā)生了填充（圖8b-c）。另外，采用跑臺運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)檢測大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，觀察修復(fù)后6個(gè)月骨骼肌的功能行為，結(jié)果表明3D支架組大鼠比空白組和3D凝膠組大鼠的跑動(dòng)距離更大，即該組小鼠具備更好的運(yùn)動(dòng)能力(圖8d-e)。通過電刺激測量肌生理反應(yīng)，在平行方向上應(yīng)用3D支架的骨骼肌損傷中的肌纖維顯著高于空白組和3D凝膠組中的肌纖維(圖8 g)。

圖8 植入FG IPN水凝膠基三維生物打印仿生支架6個(gè)月后的大鼠骨骼肌損傷模型功能肌再生測試

總結(jié)
該研究通過纖維蛋白原和GelMA的組合開發(fā)了一種應(yīng)力松弛性能可調(diào)的FG IPN 水凝膠。將FG IPN水凝膠作為生物墨水材料，通過凝膠內(nèi)支撐打印策略打印各向異性仿生支架，分別應(yīng)用于體外三維骨骼肌組織模型和體內(nèi)VML修復(fù)。研究結(jié)果表明具有更快應(yīng)力松弛的FG IPN水凝膠顯示出更好的細(xì)胞增殖和的分化特性，并能促進(jìn)微血管和肌肉生成，有利于VML修復(fù)后骨骼肌再生。因此，構(gòu)建基于FG IPN水凝膠的3D生物打印定向排列支架不僅有助于構(gòu)建準(zhǔn)確的生理學(xué)3D體外模型，而且對于體內(nèi)骨骼肌再生具有多種應(yīng)用價(jià)值。