多功能3D打印支架通過微波熱化學療法結合免疫療法根除骨肉瘤并促進骨生成

來源： EngineeringForLife

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是全球兒童和青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。雖然確診為原發(fā)性疾病的患者 5 年生存率為 60%-70%，但復發(fā)或轉移病例的預后明顯惡化，生存率降至約 20%。盡管為提高 OS 患者的無病生存率做出了大量努力，包括化療和手術相結合，但由于腫瘤復發(fā)或轉移，5 年生存率在過去 30 年中基本保持不變。因此，治療 OS 迫切需要開發(fā)其他有效的治療策略。免疫療法通常需要調動患者的免疫反應，這在過去幾年中改變了癌癥治療的模式。最近，吲哚胺 2,3-二氧化酶（IDO）因其調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫反應和促進腫瘤進展的特殊功能而成為癌癥免疫治療領域的研究熱點。IDO 的過度表達和犬尿氨酸在腫瘤組織中的積累可抑制 CD8+ T 細胞的功能，同時通過與芳基烴受體結合激活調節(jié)性 T 細胞。雖然基于 IDO 抑制劑的治療模式已被證實可獲得安全和滿意的療效，但由于腫瘤的免疫原性有限且免疫浸潤較低，導致免疫治療效果不佳，因此很少有 OS 患者能完全從治療中獲益。腫瘤復發(fā)和骨組織缺乏整合是骨肉瘤手術治療中的兩大關鍵問題。因此，高效治療骨肉瘤迫切需要一種先進的多功能治療平臺，既能消除殘余腫瘤細胞，又能促進骨再生。

為了徹底消除腫瘤并同時促進骨再生，來自中國科學院理化技術研究所的孟憲偉、Shi Cheng和Yu Zhang團隊將微波響應的沸石咪唑框架8（ZIF-8）納米材料與一種化療藥物和一種免疫檢查點抑制劑整合到3D打印的鈦支架上，從而設計出一種智能多功能治療支架。所構建的支架具有明顯的微波熱敏性和腫瘤微環(huán)境響應特性，可通過微波熱療和化療誘導腫瘤免疫原性死亡。納米復合材料支架的異位植入可增強對骨肉瘤的免疫反應，通過協(xié)同免疫療法有效抑制腫瘤復發(fā)。在長期植入過程中，ZIF-8 降解釋放的鋅離子可誘導干細胞的成骨分化。3D打印鈦支架的多孔結構和機械性能為骨再生提供了結構性微環(huán)境。這項研究為設計用于治療骨肉瘤的多功能微波響應復合支架提供了一個范例，從而可改進該疾病的治療策略。相關工作以題為“Multifunctional 3D-printed scaffolds eradiate orthotopic osteosarcoma and promote osteogenesis via microwave thermo-chemotherapy combined with immunotherapy”的文章發(fā)表在2023年7月18日的國際知名期刊《Biomaterials》。

1. 創(chuàng)新型研究內容
本研究用一步法合成了ZIF-8@DOX（ZD），先在ZD表面負載DOX，再負載IDO抑制劑，合成ZIF-8@DOX-IDO（ZDI）。然后將 ZDI 與3D打印的鈦支架整合形成 TZDI（圖 1）。TZDI 的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（圖 1b 和 c）顯示，通過3D打印獲得的支架網(wǎng)絡具有精心設計的微觀結構和粗糙的表面。放大后，可以觀察到大量 ZDI 集成在支架上。透射電子顯微鏡（TEM）觀察到的 ZDI 尺寸約為 110 nm（圖 1c），而動態(tài)光散射（DLS）檢測到的水合顆粒尺寸約為 146 nm（圖 1d），這主要是由于 DLS 檢測時納米顆粒表面的水膜造成的。通過 DLS（圖 1e）測定的 ZIF-8（Z）、ZD 和 ZDI 的水合粒徑分別為 115、135 和 146 nm，證實了它們的成功合成。Z、ZD 和 ZDI 的ζ電位分別為 32.9、11.1 和 3.1 mV（圖 1f）。X 射線衍射圖樣被進一步用來表征合成 ZD 的晶體結構。傅里葉變換紅外光譜進一步驗證了 ZD 的有效結構。在 ZD 中觀察到了 ZIF-8 中咪唑 N-H 在 3136 cm-1 處的伸縮振動和咪唑環(huán)在 1141 cm-1 處的伸縮振動。在 ZD 中還發(fā)現(xiàn)了 DOX 中位于 1728 cm-1 的 C 雙鍵 O 的伸縮振動和位于 1624 cm-1 的 C 雙鍵 C 的伸縮振動，這表明 ZD 的合成成功。此外，還利用紫外可見光譜（UV-Vis）測量了 Z、DOX、ZD、IDO 和 ZDI 的吸收光譜（圖 1g）。在 ZD 和 ZDI 中發(fā)現(xiàn)了 DOX 吸收峰，而 IDO 吸收峰僅在 ZDI 中檢測到，這進一步證實了 ZD 和 ZDI 的理想結構。能量色散 X 射線光譜分析了 TZDI 的化學成分。結果發(fā)現(xiàn)了 Ti、Zn、C、N 和 O 元素的存在，表明 ZDI 與3D打印支架的有效整合。綜上所述，這些結果表明，通過將 ZDI 集成到3D打印鈦支架表面，成功合成了 TZDI。

圖1 基于沸石咪唑酯骨架8（ZIF）的多功能藥物遞送系統(tǒng)的構建

由于 ZDI 在體外具有優(yōu)異的 MW 熱敏性和藥物控釋性能，因此有望在治療 OS 方面實現(xiàn)顯著的 MW 熱化學療法。因此，本研究對其抑制 OS 細胞生長的能力進行了評估。首先，評估了 ZDI 的體外抗腫瘤效果（圖 2）。采用典型的細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測不同納米系統(tǒng)（正常對照[NC]、Z、ZD、ZDI、NC + MW、Z + MW [ZM]、ZD + MW [ZDM]和 ZDI + MW [ZDIM]）與小鼠 OS 細胞株 K7M2 共培養(yǎng) 1、3 和 7 d 的細胞活力。結果表明，在同一時間點，與非 MW 組相比，MW 組 K7M2 的存活率明顯降低（p < 0.001），這可能是由于 MWA 引起的溫度升高所致。封裝在納米系統(tǒng)中的 DOX 可在 MW 照射下釋放到細胞內殺死 K7M2，從而導致 ZDM 組和 ZDIM 組 K7M2 的存活率隨時間而降低。結果表明，與單獨使用 MW 或 ZDI 相比，將 MW 熱療與使用納米藥物的化療相結合能更有效地殺死 K7M2 癌細胞。

圖2 不同納米復合支架系統(tǒng)的抗腫瘤效果評估

DOX 是一種免疫原性化療藥物，可誘導 ICD，進而刺激 T 細胞抗腫瘤免疫。免疫原性化療藥物可以上調癌細胞和免疫細胞中的 IDO（一種關鍵的免疫抑制劑），從而阻礙免疫細胞的功能，從而極大地抵消基于免疫原性化療的癌癥療法的治療效果。因此，在腫瘤治療中，DOX 與 IDO 抑制劑的聯(lián)用具有重要意義，它既能誘導 DOX 的化療殺傷作用，又能避免 IDO 的免疫抑制作用。癌細胞的 ICD 伴隨著一系列特征性變化，包括細胞膜上出現(xiàn) CRT、HMGB-1 暴露、骨髓樹突狀細胞（BMDC）活化、分泌 IFN-γ 的 T 細胞的抗腫瘤免疫激活等。因此，這些經(jīng)典指標可用于確定 ZDI 是否能在體外誘導 ICD。如圖 3 所示，CRT 和 HMGB-1 都是經(jīng)典的免疫原性物質，其功能可調節(jié)主要組織相容性復合體（MHC）分子的生物合成，并參與各種炎癥反應，其表達/釋放的增加可被視為免疫原性增強的標志。與其他組相比，ZDM 組和 ZDIM 組 CRT 和 HMGB-1 的表達明顯增加。ZD組和ZDI組中CRT和HMGB-1的增加是由于包封的DOX在MW輻照下部分釋放并隨后對K7M2細胞產生毒性作用。這些結果證明了納米藥物的MW熱療和化療的聯(lián)合作用，其導致腫瘤細胞的免疫性死亡，進而可能促進體內免疫細胞的激活。

圖3 不同納米復合材料支架系統(tǒng)的免疫效應體外評估

體外實驗結果證實，MW熱化學療法結合免疫療法可有效誘導OS細胞的ICD，從而促進抗腫瘤免疫，具有良好的腫瘤治療效果。接下來，本研究采用Balb/c小鼠股骨OS骨肉瘤模型評估了TZDI支架的體內抗腫瘤療效。具體實驗方案如圖 4所示。對 MW 組小鼠進行 MW 照射（1.8 W，5 分鐘）。Z、ZD 和 ZDI 組實驗小鼠的體溫普遍高于單一 MW 組，證實 Z、ZD 和 ZDI 組具有明顯的體內 MW 熱敏感性。小鼠第0、3、7和14天的照片顯示，Ti@ZD + MW（TZDM）組和Ti@ZDI + MW（TZDIM）組的腫瘤比其他組小，在相應時間點采集的股骨原位腫瘤也顯示出類似的趨勢。其中，TZDIM 組誘導的腫瘤體積縮小最為明顯，這表明在 MW 熱療、化療和免疫療法的協(xié)同作用下，TZDIM 組的抗腫瘤效果最強。14 天后小鼠腫瘤體積和重量的減少也證實了這一結果；TZDIM 組顯著抑制了腫瘤的生長。免疫組化分析進一步用于評估腫瘤組織的免疫狀態(tài)。TZDIM 組小鼠腫瘤組織中 Foxp3 和 IDO 的表達水平在第 14 天時最低，表明由于免疫檢查點 IDO 被阻斷，免疫抑制作用最弱；而 HMGB-1 和 CD11c 的表達水平最高，表明其可以有效誘導癌細胞的 ICD。

圖4 不同納米復合材料支架系統(tǒng)的體內免疫效應評估

腫瘤引流淋巴結是成熟的 DC 向 T 細胞展示捕獲的抗原，從而導致 CD8+ T 細胞功能性激活抗腫瘤免疫的關鍵位置。本研究對 Balb/c 小鼠腫瘤引流區(qū)的淋巴結細胞進行了流式細胞術檢測，主要目的是檢測 DC 和 CD8+ T 淋巴細胞的浸潤情況。具體的流式細胞術方案如圖 5 所示。結果顯示，在第七天，TZDIM 組 CD3-CD11c+ （圖 5b）和 CD3+CD8+ （圖 5e）細胞的比例是各治療組中最高的，這代表了針對腫瘤的局部免疫反應導致了 ICD。此外，還用電子顯微鏡觀察了腫瘤的組織切片。結果顯示，TZDM 組和 TZDIM 組 OS 細胞的凋亡和壞死均處于晚期，顯示出明顯的細胞器損傷。這些研究結果表明，MW 熱化學療法與免疫療法相結合可誘導癌細胞的 ICD，并有效激活免疫反應，從而有效抑制腫瘤細胞的生長并增強腫瘤細胞的凋亡。

圖5 不同納米復合材料支架系統(tǒng)對免疫細胞活化的影響

考慮到 Zn2+ 固有的成骨特性，在設計工程化多功能復合 3D 打印支架時，本研究考慮了加入 Zn2+ 以增強其成骨特性。因此，本研究初步評估了 ZIF-8 的體外成骨特性（圖 6）。通過 PCR 檢測的成骨生物標志物堿性磷酸酶（ALP）、Runx2 和骨鈣素的表達如圖 6c 所示。在第 7 天和第 14 天，ZIF-8 組的成骨基因表達明顯高于 NC 組，證實了成骨分化。測定 ALP 活性以評估早期成骨分化。第 7 天，ZIF 組的 ALP 含量略高于 NC 組；但第 14 天，ZIF-8 組的 ALP 含量顯著高于 NC 組。茜素紅染色和相應的定量分析也顯示了類似的結果。這些結果驗證了 ZIF-8 可誘導大鼠 BMSCs 產生強烈的成骨反應。此外，BMSCs的細胞骨架染色結果顯示，ZIF-8組的細胞骨架蛋白表達量和細胞鋪展度明顯高于NC組，說明ZIF-8與大鼠BMSCs的相容性更好，更有利于其粘附和生長。這些結果證明，TZDI 支架能為大鼠 BMSCs 的成骨分化提供良好的環(huán)境，誘導更強的成骨反應。

圖6 ZIF-8 對骨生成的影響

通過將 TZDI 支架植入斯普拉格-道利（SD）大鼠的股骨，本研究評估了 TZDI 支架的體內成骨潛力（圖 7）。4 周和 12 周后，收集樣本進行顯微 CT 掃描和重建分析。在圖 7b 中，支架的紅色表面是新骨。與鈦組相比，TZDIM 組有更多的新骨，這表明負載 ZIF-8 的支架具有更好的生物活性，能誘導新骨生成。此外，BV/TV、Tb-Th、Tb. Sp、Tb-N 和骨礦物質密度進行了定量分析。BV/TV 是骨組織體積與組織總體積之比，代表骨體積分數(shù)，BV/TV 的增加直接反映了新骨形成的增強。Tb。Th 代表骨小梁的平均厚度，而 Tb. N 代表相關區(qū)域內每毫米骨與非骨交叉的平均數(shù)量。Tb. Th和Tb-N的升高表明骨合成比骨分解增強。Tb. Sp 代表骨小梁之間髓質空間的平均寬度。Tb. Sp 的減少表明骨量增加，骨結構增強。結果顯示，ZIF 負載支架組的這些指標明顯高于 Ti 支架組。血紅素和伊紅（H&E）染色結果見圖 7h，其中黑色部分為支架，紅色部分為新骨。在第 4 周和第 12 周，ZIF 負載支架組的新生骨量明顯高于 Ti 支架組。用 Masson 三色染色法評估不同組的骨成熟度。結果顯示，在第 4 周和第 12 周，TZDI 支架周圍紅色區(qū)域的新骨量高于 Ti 支架組，這也證實了 ZIF-8 支架加速了新骨的成熟速度。

圖7 TZDI 納米復合材料支架對骨生成的體內影響

2. 總結與展望
本研究通過在3D打印鈦支架上整合負載有化療藥物和免疫檢查點抑制劑的 ZIF-8 納米材料，設計并制造了一種智能多功能 MW 響應復合支架。這使得高療效的骨肉瘤矯形治療和生物活性更強的骨再生成為可能。支架優(yōu)異的MW熱增強特性實現(xiàn)了MW熱療法、免疫療法和化療之間的有效協(xié)同。重要的是，MW 熱療和化療通過誘導腫瘤細胞的 ICD 顯著增強了適應性免疫反應。結合在腫瘤微環(huán)境中釋放的 IDO 抑制劑，BMDCs 和 CD8+ T 淋巴細胞可被進一步共同刺激，從而殺死腫瘤細胞。值得注意的是，ZIF-8 釋放的 Zn2+ 不僅能促進 BMSCs 的成骨分化，還能增強體內新骨的生成。因此，這種集腫瘤治療與骨再生于一體的多功能支架為OS的術后治療提供了一種高效的多功能策略。

文章來源：
https://www.sciencedirect.com/sc ... i/S0142961223002442