中國(guó)科學(xué)院大學(xué)：3D打印高保真度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞定向的人造結(jié)締組織

來(lái)源： EngineeringForLife

制造具有高打印保真度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物相容性和細(xì)胞定向的結(jié)締組織對(duì)于生物墨水仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。膠原蛋白，作為提供體內(nèi)強(qiáng)度的固有纖維，是組織打印的理想材料。然而，目前的膠原蛋白-生物墨水表現(xiàn)出較差的可打印性和機(jī)械性能。近日，來(lái)自中國(guó)科學(xué)院大學(xué)的鄭雄飛教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了高保真度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞定向的人造結(jié)締組織3D打印的相關(guān)研究。研究成果以“Bioprinting of light-crosslinkable neutral-dissolved collagen to build implantable connective tissue with programmable cellular orientation”為題于2023年04月12日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 光交聯(lián)中性溶解膠原蛋白生物打印實(shí)現(xiàn)打印保真、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性和細(xì)胞定向

本文開(kāi)發(fā)了一種可光交聯(lián)降冰片-膠原蛋白（NorCol），具有完整膠原蛋白結(jié)構(gòu)的NorCol表現(xiàn)出出色的剪切稀化性能和光交聯(lián)強(qiáng)度，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，具有良好的打印保真度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。不同濃度中性溶解的NorCol直接集成到打印具有復(fù)合模量的純膠原蛋白結(jié)構(gòu)中，具有較強(qiáng)生物相容性，模仿細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）異質(zhì)微結(jié)構(gòu)。該復(fù)合結(jié)構(gòu)在皮下移植時(shí)對(duì)宿主組織和毛細(xì)血管進(jìn)行廣泛滲透。通過(guò)設(shè)計(jì)印刷絲緊密接口，構(gòu)建了幾何指導(dǎo)和模量無(wú)關(guān)的各向異性機(jī)械環(huán)境，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞定向。此外，細(xì)胞取向與打印高濃度NorCol方向一致，這與體內(nèi)細(xì)胞和膠原纖維情況相同。NorCol的這種能力為打印基于純ECM蛋白的、可植入的和功能性的構(gòu)造物開(kāi)辟了新天地，適用于人類應(yīng)用的結(jié)締組織工程。

圖2 NorCol具有完整的膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出強(qiáng)剪切稀化性能、光交聯(lián)強(qiáng)度、可打印性和打印保真度

預(yù)水凝膠的剪切稀化特性使其很容易從噴嘴中噴出不會(huì)發(fā)生物理堵塞，預(yù)水凝膠的自愈特性使其在擠出后保持連續(xù)的絲狀，并在沉積后保持其形狀，形成一個(gè)具有高保真度的整體結(jié)構(gòu)。HiNorCol的粘度顯示隨著濃度的增加，粘度迅速增加。由于剪切率的增加，所有濃度都觀察到剪切變薄的現(xiàn)象。流變學(xué)研究證實(shí)NorCol溶液的自愈特性。應(yīng)用高剪切應(yīng)變（400%）導(dǎo)致NorCol溶液被完全破壞，使溶液變成了彈性下降（G′）的液體狀態(tài)。這種自我修復(fù)的行為可能是由于膠原蛋白分子之間的非共價(jià)相互作用的快速和可逆的重建。HiNorCol更接近于固體水凝膠，在靜態(tài)狀態(tài)下表現(xiàn)出形狀保持性能。在剪切力作用下，NorCol迅速轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w特性，并在剪切力消除后迅速恢復(fù)為固體特性。這些可調(diào)整的機(jī)械性能，與3D打印的分散和積累過(guò)程完全匹配。NorCol光交聯(lián)的機(jī)械性能顯示對(duì)于不同濃度的低度和高度的NorCol（1 w/v%、3 w/v%和5 w/v%），在紫外光照射下，凝膠化轉(zhuǎn)變迅速發(fā)生。NorCol中的光敏基團(tuán)的程度較低，大分子只需要少量的交聯(lián)點(diǎn)來(lái)形成更緊密的網(wǎng)絡(luò)就可達(dá)到滿意的剪切模量。

圖3 打印脂肪組織的細(xì)胞活力、增殖和分化

接下來(lái)打印了直徑為10毫米、高度為5毫米（32層）的脂肪組織，以驗(yàn)證細(xì)胞的活力和分化能力。HiNorCol具有良好的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，可以支持大體積組織的形成和連續(xù)培養(yǎng)，但其高粘度和密集的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)不適合作為細(xì)胞填充材料。使用HiNorCol和LoNorCol的混合打印來(lái)實(shí)現(xiàn)脂肪組織的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和細(xì)胞兼容性。脂肪生成或血管形成都需要緊密組織之間的營(yíng)養(yǎng)交換。本研究使用LoNorCol與3% w/v的明膠作為細(xì)胞填充材料。打印頭的溫度控制在18度，打印底板的溫度控制在10度。結(jié)果顯示加入明膠的LoNorCol形成一個(gè)絲狀結(jié)構(gòu)，整個(gè)結(jié)構(gòu)有明顯的孔隙。培養(yǎng)21天后，打印的結(jié)構(gòu)仍然保持整體完整和精細(xì)的結(jié)構(gòu)。Bodipy染色是一種親脂性亮綠色染色劑，可以對(duì)非極性脂質(zhì)進(jìn)行染色，對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的染色很敏感。結(jié)果顯示染色細(xì)胞分布在LoNorCol的內(nèi)部，而HiNorCol的表面只分布有少量的脂質(zhì)滴。進(jìn)一步證明，與支架表面相比，LoNorCol中的脂肪生成分化表現(xiàn)出數(shù)量和穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)。為了評(píng)估打印BMSCs的分化，還分析了組織特異性基因的表達(dá)。與基本培養(yǎng)基相比，當(dāng)BMSCs在成脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，觀察到成脂主調(diào)控因子PPARγ的表達(dá)明顯增加，同時(shí)早期成脂標(biāo)志物L(fēng)PL也有增加，結(jié)合油紅O和Bodipy的染色結(jié)果，細(xì)胞分化為脂肪組織的趨勢(shì)是明顯的。

圖4 誘導(dǎo)細(xì)胞取向的打印結(jié)構(gòu)幾何設(shè)計(jì)

皮膚和肌腱分別是不規(guī)則致密結(jié)締組織和規(guī)則致密結(jié)締組織。在皮膚組織中，膠原纖維形成高階網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成主要的真皮結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)多方向的拉力，肌腱在膠原纖維結(jié)構(gòu)中帶有更多的定向模式，在肌肉收縮時(shí)傳遞和承受單向的張力。建立定向的細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)結(jié)締組織的體外重塑具有重要意義。本研究將HiNorCol和LoNorCol在同一方向上交替打印，限制LoNorCol在打印方向上的收縮。HiNorCol的較高硬度將通過(guò)粘附界面?zhèn)鬟f給含有細(xì)胞的LoNorCol。細(xì)胞遵循硬度梯度的趨勢(shì)，是細(xì)胞定向的根本原因。細(xì)胞內(nèi)的分子馬達(dá)，如肌球蛋白II，通過(guò)剛性的肌動(dòng)蛋白絲束和順應(yīng)性的跨膜分子離合器，如整合素，將力傳遞給ECM。單一的馬達(dá)-離合器引起不同的變形，成為柔軟或堅(jiān)硬的基質(zhì)，導(dǎo)致?tīng)恳�力和F-actin的逆向流速的差異，反過(guò)來(lái)又影響了細(xì)胞行為。該結(jié)果表明當(dāng)一個(gè)細(xì)胞在前部和后部對(duì)基質(zhì)施加相等的力時(shí)，不同程度變形了僵硬程度分級(jí)的ECM，在軟邊緣比僵硬邊緣變形更多，從而導(dǎo)致細(xì)胞中心向基質(zhì)較硬區(qū)域轉(zhuǎn)移。在三維環(huán)境中，基質(zhì)硬度的增加也會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞的萌發(fā)和生長(zhǎng)。

圖5 打印肌腱結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)

研究人員打印了不同的肌腱結(jié)構(gòu)，以揭示肌腱厚度和長(zhǎng)絲大小對(duì)細(xì)胞取向的影響。增加厚度的肌腱結(jié)構(gòu)被稱為加厚的肌腱。用兩根錐形HiNorCol絲來(lái)增加硬段比例的肌腱結(jié)構(gòu)被稱為雙HiNorCol絲。在培養(yǎng)7天后，所有組別都顯示出明顯的細(xì)胞定向。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果也顯示所有組別都有較高的細(xì)胞定向，三組之間沒(méi)有明顯的差異。根據(jù)上文的假設(shè)，增加硬塊的比例不會(huì)減少肌腱結(jié)構(gòu)垂直方向上的剛度差異。不同厚度的肌腱顯示出相似的細(xì)胞方向，證明Z方向結(jié)構(gòu)的變化對(duì)xy平面的影響很小，進(jìn)一步證明將三維凝膠簡(jiǎn)化為二維是可行的。晚期約束的方法對(duì)引導(dǎo)細(xì)胞取向具有廣泛的適應(yīng)性。接著還觀察了細(xì)胞向HiNorCol遷移的過(guò)程。第7天，細(xì)胞開(kāi)始爬到HiNorCol的表面。14天時(shí)，NiNorCol被細(xì)胞完全覆蓋。

本文開(kāi)發(fā)了一種新的基于膠原蛋白混合打印系統(tǒng)，具有高打印保真度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物相容性和細(xì)胞活性，適用于結(jié)締組織重建�；�于完整的膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)，NorCol隨著濃度的增加顯示出優(yōu)異的擠出性能和可調(diào)節(jié)的機(jī)械強(qiáng)度，使得HiNorCol能夠打印出復(fù)雜、精致和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。體內(nèi)植入結(jié)果證實(shí)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對(duì)于軟水凝膠在原位保持不流失，加速組織和血管向打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的浸潤(rùn)至關(guān)重要。結(jié)合LoNorCol，打印了大量的脂肪組織，其中BMSCs分化為脂肪生成細(xì)胞。依靠NorCol緊密結(jié)合界面，構(gòu)建了一個(gè)由幾何結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的、與模量無(wú)關(guān)的差異性三維剛度環(huán)境，并實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞定向以重塑肌腱和皮膚組織。本研究設(shè)計(jì)的NorCol打印系統(tǒng)證明是解決結(jié)締組織建設(shè)中分子、細(xì)胞和組織層面多尺度力學(xué)要求的一種有前途的方法。應(yīng)該加速純膠原蛋白作為組織工程和再生醫(yī)學(xué)重要生物材料的應(yīng)用，并提高研究人員對(duì)組織打印中細(xì)胞機(jī)械微環(huán)境的關(guān)注。

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