哈佛大學(xué)的David J. Mooney教授研究團(tuán)隊(duì)在Nature Materials|生物墨水/基質(zhì)粘彈性如...

細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境的生物和物理因素調(diào)節(jié)了群體細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和組織樣式。然而，基質(zhì)的粘彈性特質(zhì)如何調(diào)節(jié)群體細(xì)胞的在空間和時(shí)間上的行為仍是未知之謎。近日，一篇名為“Matrix viscoelasticity controls spatiotemporal tissue organization”的文章由哈佛大學(xué)的David J. Mooney教授研究團(tuán)隊(duì)在Nature Materials (IF=41.68)上發(fā)表。這篇研究指明包裹球形乳腺上皮細(xì)胞團(tuán)簇的粘彈性基質(zhì)可以指導(dǎo)在空間和時(shí)間上的組織增殖。基質(zhì)的粘彈性促進(jìn)了細(xì)胞團(tuán)簇的不對稱性增加，形成了侵入性指狀突起，在體內(nèi)和體外都可以觀察到Y(jié)AP核遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）現(xiàn)象。通過上述觀察結(jié)果的建模，研究建立了與基質(zhì)粘彈性，組織粘度，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和細(xì)胞分裂速率相關(guān)的形態(tài)學(xué)穩(wěn)定性分析相圖，其通過腸類器官的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。總之，這項(xiàng)工作強(qiáng)調(diào)了應(yīng)力松弛機(jī)制在組織生長動(dòng)力學(xué)中的作用，揭示了組織生長動(dòng)力學(xué)是形態(tài)發(fā)生和腫瘤發(fā)生的基本過程。

組織樣式與許多生物過程相關(guān)，包括細(xì)胞數(shù)量，大小，形狀和位置的改變，上述過程也可能導(dǎo)致組織對稱性破壞，產(chǎn)生屈曲，折疊，撕裂，出芽或分支等現(xiàn)象。在分子水平上，組織的行為受內(nèi)在基因表達(dá)和各種物理化學(xué)因素的調(diào)控。雖然化學(xué)物質(zhì)梯度在發(fā)育生物學(xué)中起到關(guān)鍵作用，但是三維(3D)細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)中的力學(xué)刺激在調(diào)節(jié)組織和形態(tài)發(fā)生方面也同樣起到關(guān)鍵作用。盡管已有大量研究探索剛度對組織結(jié)構(gòu)中的影響，然而基質(zhì)的粘彈性在組織發(fā)生中的作用尚不明確。事實(shí)上，ECM的隨時(shí)間改變的粘彈性特征越來越被認(rèn)為是形態(tài)發(fā)生中的重要參與者，且基質(zhì)粘彈性已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)單細(xì)胞行為，但是它是如何調(diào)節(jié)群體細(xì)胞行為還不清楚。研究人員假設(shè)了組織結(jié)構(gòu)將受到基質(zhì)的粘彈性特性的影響，設(shè)置了彈性固體到粘性液體等不同粘彈性組別，應(yīng)力松弛時(shí)間范圍從1秒到幾百秒不等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確證明了粘彈性基質(zhì)/生物墨水在常用的體外發(fā)育和病理模型（乳腺癌生長和腸類器官發(fā)育）中可調(diào)節(jié)組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)證明了應(yīng)力松弛可以影響組織生長動(dòng)力學(xué)和手指樣的不對稱結(jié)構(gòu)形成，是形態(tài)發(fā)生和腫瘤發(fā)生的基本過程。

基質(zhì)材料/生物墨水的配置

文章首先研究了粘彈性生物墨水對 MCF10A 非惡性乳腺上皮細(xì)胞團(tuán)簇組織生長的影響，MCF10A 乳腺上皮細(xì)胞以被廣泛用于研究乳腺發(fā)育和腫瘤發(fā)生。選擇由天然多糖海藻酸鹽形成的水凝膠作為生物墨水，因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞不表達(dá)降解該聚合物的酶，從而消除與基質(zhì)降解有關(guān)的影響。這些凝膠的相對粘彈性可以獨(dú)立于剛度，孔徑和粘附配體地改變。改變方法是通過改變海藻酸鹽的分子量和鈣交聯(lián)劑的濃度來實(shí)現(xiàn)粘彈性變化，以創(chuàng)建固定彈性模量(G ′≈5,000 Pa)的生物墨水，但是不同組別應(yīng)力松弛時(shí)間在30s到350s變化，具體為彈性體應(yīng)力松弛時(shí)間更長粘彈性體改時(shí)間更短。由于海藻酸鹽不存在整聯(lián)蛋白粘附配體，所以將含有 Arg-Gly-Asp (RGD)的肽綴合到聚合物骨架上以在所有凝膠中提供恒定水平的細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)。

圖1. A,示意圖說明如何同時(shí)改變聚合物的分子量和交聯(lián)程度允許在恒定的凝膠剛度下改變粘彈性能。B，所得海藻酸鹽水凝膠的儲(chǔ)存模量 (每個(gè)條件 n = 5,9個(gè)凝膠)。C，在一定應(yīng)變下，最初施加的應(yīng)力放松到原始值的一半的時(shí)間尺度的量化。D，MCF10A 細(xì)胞團(tuán)簇在彈性和粘彈性水凝膠中生長超過5天的實(shí)例。青色，鬼筆環(huán)肽; 洋紅色，Hoechst。面積(e)和圓度(f)的量化。G，在彈性和粘彈性凝膠中生長的 MCF10A 細(xì)胞球體中磷酸化 FAK 人黏著斑激酶。灰色，pFAK; 洋紅色，Hoechst (每個(gè)條件 n = 3,4個(gè)圖像)。H，彈性和粘彈性凝膠(球體核心細(xì)胞和分支細(xì)胞)中球體的鬼筆環(huán)肽(青色) ，Hoechst (洋紅色)(上排)和 YAP (下排)染色的代表性例子。I，每個(gè)圖像具有核 YAP 的細(xì)胞百分比的染色進(jìn)行定量。

粘彈性生物墨水對乳腺癌團(tuán)簇生長的影響

隨著時(shí)間的推移，彈性基質(zhì)中的組織生長緩慢，形態(tài)穩(wěn)定; 它們在保持球形對稱性的同時(shí)體積增大。然而，粘彈性基質(zhì)中的組織生長得更快。隨著尺寸的增加，它們表現(xiàn)出形態(tài)不穩(wěn)定性，球形對稱性被破壞，形成手指突出并侵入基質(zhì)材料，導(dǎo)致表面積顯著增加和圓度降低。這些差異是由生物墨水力學(xué)特性的變化引起的，研究接下來集中在細(xì)胞中的兩個(gè)力學(xué)敏感通路，粘著斑激酶(FAK)和機(jī)力學(xué)敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 YAP。粘彈性生物墨水促進(jìn)磷酸化的 pFAK 粘附的表達(dá)和形成，但彈性生物墨水中沒有類似現(xiàn)象，而 YAP 保留在彈性生物墨水細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，但在粘彈性生物墨水中移位到指狀突出細(xì)胞的細(xì)胞核中。

A, 在粘彈性凝膠中生長的細(xì)胞團(tuán)簇中波形蛋白(青色) ，鬼筆環(huán)肽(洋紅色)染色。B，彈性水凝膠中球體外環(huán)和粘彈性水凝膠中指狀突出中波形蛋白平均強(qiáng)度的定量。C, 鬼筆環(huán)肽和 Hoechst (左)和細(xì)胞角蛋白14(右)在粘彈性和彈性水凝膠球體染色的例子。青色，鬼筆環(huán)肽; 洋紅色，霍克斯特; 黃色，細(xì)胞角蛋白14。D，球體外環(huán)平均細(xì)胞角蛋白14強(qiáng)度的定量。E-g，彈性和粘彈性基質(zhì)中球體中 Snail (e) ，Slug (f)或 Zeb1(g)陽性細(xì)胞百分比的定量。H，第0天用含有 MDA-MB-231乳腺上皮細(xì)胞的粘彈性和彈性水凝膠注射的小鼠中腫瘤體積的定量。I，在彈性和粘彈性水凝膠中 MDA-MB-231的鬼筆環(huán)肽和 Hoechst 染色。青色，鬼筆環(huán)肽; 洋紅色，Hoechst。J，植入裸鼠體內(nèi)的粘彈性和彈性水凝膠中 MCF10A 球體的鬼筆環(huán)肽和 Hoechst (左) ，線粒體(中)和波形蛋白(右)染色。K，植入小鼠體內(nèi)7天的彈性和粘彈性基質(zhì)中球體中的slug陽性細(xì)胞百分比的定量。

粘彈性生物墨水中觀察到的行為更符合真實(shí)細(xì)胞行為，包括上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMTs)。波形蛋白在指狀突出中表達(dá)更高，細(xì)胞角蛋白在粘彈性基質(zhì)中的細(xì)胞團(tuán)簇中表達(dá)低，EMT 轉(zhuǎn)錄因子 Snail，Slug 和 Zeb1在粘彈性基質(zhì)中的細(xì)胞中表達(dá)更高。此外，許多癌癥相關(guān)通路在彈性基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞中沒有改變，但在粘彈性剛性水凝膠中上調(diào)。為了確定粘彈性是否可以增強(qiáng)細(xì)胞團(tuán)簇在體內(nèi)的生長，我們采用了兩種方法。首先，在 NOD-SCID 小鼠體內(nèi)注射包裹在粘彈性或彈性生物墨水中的MDA-MB-231惡性乳腺上皮細(xì)胞，腫瘤在粘彈性基質(zhì)中的生長速度明顯快于彈性基質(zhì)。MDA-MB-231細(xì)胞在體外也生長得更快。其次，將包裹在粘彈性或彈性基質(zhì)中的MCF10A 細(xì)胞團(tuán)簇注射到 NU/J 小鼠體內(nèi)。1周后，研究觀察到粘彈性基質(zhì)中細(xì)胞的顯著生長和指狀突出形成，而彈性基質(zhì)中的細(xì)胞僅顯示有限的生長。此外，體內(nèi)的細(xì)胞在粘彈性生物墨水中表達(dá)更多的波形蛋白和 Slug。研究結(jié)果表明，基質(zhì)粘彈性可以促進(jìn) EMT 和腫瘤生長。

粘彈性生物墨水對群體細(xì)胞行為的影響作用模型

為了理解組織形態(tài)對稱性破壞的量化條件，研究引入最小系統(tǒng)理論模型，從限制在粘彈性生物墨水內(nèi)生長的活性增殖細(xì)胞的兩相系統(tǒng)開始。將組織中的單個(gè)細(xì)胞模擬為在粘性液體中大小一定的過阻尼軟彈性球體，其在三種力的影響下移動(dòng): (1)細(xì)胞之間的相互作用，包括(a)短程排斥以防止重疊和(b)中間范圍(兩個(gè)細(xì)胞長度)的吸引力，兩者一起產(chǎn)生由細(xì)胞分裂增殖驅(qū)動(dòng)的壓力；(2)細(xì)胞與周圍粘彈性生物墨水之間的作用力包括(a)相互作用的吸引勢，該值與儲(chǔ)存模量 G ′相關(guān)和(b)防止重疊的短程斥力；以及(3)相對于彼此在生物墨水內(nèi)隨機(jī)移動(dòng)的活細(xì)胞，擁有屬性為運(yùn)動(dòng)能力M。此外，在該模型中，假定界面處的細(xì)胞具有對周圍基質(zhì)材料施加力的能力。整個(gè)系統(tǒng)隨著細(xì)胞的增殖和/或遷移而變化，基質(zhì)材料對伴隨細(xì)胞施加的壓力做出被動(dòng)的反應(yīng)。當(dāng)應(yīng)力超過規(guī)定的閾值時(shí)，基質(zhì)材料中細(xì)胞與基質(zhì)之間的結(jié)合位點(diǎn)可能斷裂，從而形成新的結(jié)合位點(diǎn); 這最有可能發(fā)生在組織與基質(zhì)材料的界面處，從而導(dǎo)致了邊界的動(dòng)態(tài)演變。其次，潛在的機(jī)制驅(qū)動(dòng)組織運(yùn)動(dòng)和增殖的細(xì)胞規(guī)模進(jìn)行了探討。之前的研究認(rèn)為，單個(gè)細(xì)胞對三維和二維粘彈性的反應(yīng)是由肌動(dòng)球蛋白收縮力或拉伸離子通道調(diào)節(jié)而導(dǎo)致。而該模型顯示，細(xì)胞通過推動(dòng)基質(zhì)產(chǎn)生分裂和遷移的空間。與此相一致的是，當(dāng)模型中的細(xì)胞增殖速率受到抑制時(shí)，預(yù)測組織生長和不穩(wěn)定性將大大減少。對于彈性生物墨水中的細(xì)胞，細(xì)胞分裂將在空間上局限于生長組織和基質(zhì)材料之間的邊界，但是對于粘彈性基質(zhì)中的細(xì)胞，細(xì)胞分裂將更廣泛地分布在整個(gè)生長組織。另外基于上述假設(shè)的模擬預(yù)測隨著基質(zhì)材料模量的增加，組織形態(tài)不穩(wěn)定性將增強(qiáng)。

A，組織的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)是基質(zhì)剛度的正相關(guān)函數(shù)，B-D，最終時(shí)間點(diǎn)模擬圖像，投影面積和圓度。通過進(jìn)一步改變彈性和粘彈性凝膠中的交聯(lián)程度，改變了實(shí)驗(yàn)生物墨水的剛度。F，實(shí)驗(yàn)樣品在彈性和粘彈性的不同剛度基質(zhì)材料培養(yǎng)5天的面積和G圓度。H，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力歸零后的模型模擬結(jié)果。I，具有 Rac1(NSC23766)和 Arp2/3(CK666)抑制劑的軟和硬粘彈性基質(zhì)中培養(yǎng)5天后的樣品。J，模型預(yù)測的彈性/粘彈性材料中不同剛度下的細(xì)胞增殖。K，不同培養(yǎng)條件下EdU 陽性細(xì)胞百分比。

粘彈性生物墨水對類器官生長的影響

研究也進(jìn)行了粘彈性生物墨水對自組織腸類器官生長的影響評估。粘彈性生物墨水同樣促進(jìn)了腸類器官生長，對稱性破壞和隱窩形成，但類器官在彈性生物墨水中生長更緩慢，并保持其球形對稱�？偟膩碚f，這些結(jié)果驗(yàn)證了生物墨水粘彈性對組織生長影響模型的普適性。

A，用于類器官研究的海藻酸鹽和基質(zhì)膠共混生物墨水示意圖。粘彈性受聚合物分子量和交聯(lián)劑濃度控制，而 Matrigel 的濃度保持不變。B，彈性和粘彈性海藻酸鈉-基質(zhì)膠互穿網(wǎng)絡(luò)的儲(chǔ)存模量。C，培養(yǎng)7天的彈性和粘彈性水凝膠中的腸類器官鬼筆環(huán)肽和 Hoechst 染色。青色，鬼筆環(huán)肽; 洋紅色，Hoechst。D，E，在彈性和粘彈性基質(zhì)中7天內(nèi)的類器官面積和圓度變化。F，在較硬的粘彈性凝膠中培養(yǎng)7天后Lgr5 + ，鬼筆環(huán)肽和 Hoechst腸類器官染色。左: Lgr5 + (洋紅色)和 Hoechst (青色) ; 右: 鬼筆環(huán)肽。G，在較硬的粘彈性凝膠中培養(yǎng)7天后溶菌酶，鬼筆環(huán)肽和 Hoechst 染色。每個(gè)條件 n = 9個(gè)圖像。左: 溶菌酶(洋紅色)和 Hoechst (青色) ; 右: 鬼筆環(huán)肽。H，不同生物墨水中GFP+和聚落形成對比。

結(jié)論

該研究證明了粘彈性生物墨水如何調(diào)節(jié)群體細(xì)胞行為，暗示對稱性的破壞與許多生理過程相關(guān)，包括胚胎發(fā)生，癌發(fā)生，分支形態(tài)發(fā)生和血管生成。同時(shí)提供一個(gè)思路來了解組織在正常和病理狀態(tài)的形態(tài)，并用相圖策略來指導(dǎo)組織形態(tài)調(diào)控和再生醫(yī)學(xué)。

參考文獻(xiàn)

Elosegui-Artola, A., Gupta, A., Najibi, A.J., et al. Matrix viscoelasticity controls spatiotemporal tissue organization [J]. Nature Reviews Materials, 2022: 1-15. https://doi.org/10.1038/s41563-022-01400-4