基于微組織的生物墨水--軟骨細胞“微型避難所”用于投影式光固化生物3D打印

來源：EngineeringForLife

現(xiàn)階段，生物打印3D打印具有強大生命力的特定組織仍存在巨大的挑戰(zhàn)，需要在細胞密度和水凝膠網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)密度之間取得平衡。由組織特異性間充質(zhì)干細胞和脫細胞基質(zhì)微粒組成的微組織提供了一種實現(xiàn)仿生細胞密度和微環(huán)境的替代方案。然而，迄今為止，由于制造過程中的不穩(wěn)定性，很少有研究用3D打印方法來制造它們。

為此，來自武漢協(xié)和醫(yī)院整形外科的孫家明教授、汪振星教授團隊開發(fā)了一種具有良好打印性和生物相容性的微組織生物墨水用于投影式光固化生物3D打印（EFL-BP-8600）。該研究通過將脫細胞基質(zhì)微粒與GelMA水凝膠按一定比例交聯(lián)的方法制備微組織生物墨水，所得到的微組織生物墨水具有理想的機械性能和溶脹率，對可打印性幾乎沒有影響。此外，研究團隊使用基于殘耳軟骨細胞的微組織生物墨水制備了精細的耳廓結(jié)構(gòu)，打印耳中的殘耳軟骨細胞在體外細胞增殖和體內(nèi)耳軟骨再生方面均有明顯優(yōu)勢。該種微組織復(fù)合生物墨水，不僅能夠準確組裝器官構(gòu)建塊，還可以為細胞提供一個三維避難所，以確保打印細胞的生存能力。相關(guān)工作以題為“Microtissue-Based Bioink as A Chondrocyte Micro-Shelter for DLP Bioprinting”發(fā)表在Advanced Healthcare Materials雜志上。

圖1 微組織生物墨水的制備及其用于投影式光固化生物打印的示意圖

1. 殘耳軟骨細胞的提取與鑒定
首先，作者從小耳畸形患者的廢棄殘耳組織中提取殘耳軟骨細胞，并進行體外擴增和鑒定（圖2）。作者分別對其軟骨細胞特性和干細胞特性進行檢測。免疫熒光結(jié)果顯示，提取的殘耳軟骨細胞可以陽性表達軟骨細胞相關(guān)標志物COL2和Aggrecan（圖2B），以及干細胞相關(guān)標志物CD90、CD105和CD73（圖2C）。qRT-PCR結(jié)果同樣顯示，軟骨細胞相關(guān)基因COL2A1、Aggrecan和Elastin（圖2D），干細胞相關(guān)基因OCT4A、NANOG和SOX2（圖2E）在第1、2、3代殘耳軟骨細胞中均有不同水平的表達。以上結(jié)果表明，作者提取的殘耳軟骨細胞兼具軟骨細胞特性和干細胞特性，與既往報道相符，并將用于下一步實驗。

圖2 殘耳軟骨細胞的提取與鑒定

2. 軟骨脫細胞基質(zhì)（CAM）的制備及微組織的構(gòu)建
作者通過物理/化學(xué)/酶相結(jié)合的方法，成功制備了豬耳軟骨脫細胞基質(zhì)（CAM）（圖3A）。組織學(xué)染色、DNA定量和GAG定量檢測結(jié)果均顯示，實驗室制備的脫細胞基質(zhì)符合國際標準（圖3B-D）。接著，作者使用冷凍研磨法，將CAM制備成百微米級別的不溶性顆粒，作為微載體用于后續(xù)實驗（圖3E、F）。接種殘耳軟骨細胞后培養(yǎng)1、3、5天，細胞可以在CAM微載體上鋪展、增殖，并分泌細胞外基質(zhì)（圖3G-I）。

圖3 軟骨脫細胞基質(zhì)(CAM)的制備及軟骨微組織的構(gòu)建

3. CAM生物墨水的制備及表征
為了探究合適的生物墨水配方，作者分別對不同濃度、不同粒徑的CAM墨水進行測試，以選擇最佳配方用于體外細胞培養(yǎng)和體內(nèi)軟骨再生實驗。作者將單純GelMA、含1%CAM、5%CAM、10%CAM的GelMA墨水進行流變學(xué)測試、力學(xué)測試和溶脹率測試（圖4A-E）。結(jié)果顯示，含10%CAM組墨水的黏度最高、力學(xué)性能最強（壓縮模量約為單純GelMA的6.5倍）、溶脹率最低，更利于軟骨細胞的長期存活、增殖和軟骨微環(huán)境的仿生。因此，含有10%CAM的墨水配方被用于后續(xù)實驗中。

接著，為保證復(fù)合墨水的相對均質(zhì)性，作者將CAM篩選成0-150μm，150-300μm和＞300μm三組，并進行力學(xué)性能測試和溶脹率測試。結(jié)果顯示，相同濃度下，0-150μm組的墨水力學(xué)性能更強，更接近天然軟骨組織，而三組溶脹率并無統(tǒng)計學(xué)差異（圖4F、G）。

圖4 含有不同CAM濃度配比和粒徑大小的生物墨水材料學(xué)表征

由于在投影式光固化3D打印的過程中，生物墨水基本處于靜置狀態(tài)，因此墨水的均質(zhì)性是影響打印模型中微組織是否分布均勻的關(guān)鍵因素之一�；�于此，作者繼續(xù)對不同粒徑CAM的復(fù)合墨水進行沉降實驗，以觀察在打印過程（不超過3h）內(nèi)，生物墨水中CAM的沉降情況（圖5）。作者分別觀察了37℃下，含有10%不同粒徑（0-150μm、150-300μm和＞300μm）CAM的沉降過程，并對沉降距離進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，0-150μm組的CAM復(fù)合墨水在3h內(nèi)幾乎不發(fā)生沉降現(xiàn)象，而隨著CAM粒徑的增加，150-300μm和＞300μm組的復(fù)合墨水在第1h時即觀察到明顯的沉降現(xiàn)象，第3h時沉降距離增加，且三組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異。因此，0-150μm的CAM更能保證該復(fù)合生物墨水在打印過程中的均質(zhì)性。

圖5 在10% w/v濃度下，含有不同粒徑CAM的生物墨水在37℃下的沉降特性

基于上述實驗結(jié)果，作者選擇濃度為10%w/v、粒徑為0-150μm的CAM微粒與10%w/v的GelMA進行混合，用于后續(xù)生物墨水的制備及打印（圖6A）。接著，作者對該符合生物墨水的可打印性進行測試，以探討CAM的加入是否會影響光固化打印性能。作者首先對打印參數(shù)進行了測試，結(jié)果表明，CAM的加入使單層曝光時間由30s延長到了35s，但仍能實現(xiàn)模型的交聯(lián)定型（圖6B）。通過打印不同精度的模型，測試CAM的加入對可打印性的影響。結(jié)果顯示，加入CAM后，與單純的GelMA相比，打印模型的透明度降低、邊緣略顯粗糙，但基本不會影響打印精度，同時還會提高模型的力學(xué)性能，使模型的支撐性能更強（圖6C）。作者打印出立體和平面的耳型支架，并進行彈性測試（圖6D-F）。結(jié)果顯示，加入CAM后，打印模型對應(yīng)的解剖結(jié)構(gòu)清晰可見，彈性更強。說明本研究制備的復(fù)合生物墨水可滿足投影式光固化3D打印要求，具有良好的打印性和彈性。

圖6 CAM生物墨水的可打印性測試

4. 微組織生物墨水的生物打印及體外長期培養(yǎng)
作者將殘耳軟骨細胞接種于CAM微載體上構(gòu)建軟骨微組織，混合GelMA后制備出微組織生物墨水并打印成耳型支架，用于體外長期培養(yǎng)。結(jié)果顯示，與單純的GelMA+細胞組相比，GelMA+微組織組中的軟骨細胞增殖更快、更加鋪展、細胞外基質(zhì)分泌更多（圖7C、D），軟骨相關(guān)標志物Aggrecan和COL2的表達水平更高（圖7E、F）。Transwell結(jié)果顯示，與微組織共培養(yǎng)的軟骨細胞中COL2的水平更高，可能是由于微組織上的細胞可以分泌更多的軟骨相關(guān)生長因子（圖7G、H）。以上結(jié)果表明，微組織生物墨水在體外長期培養(yǎng)中效果更好。

圖7 微組織生物墨水的生物打印和體外長期培養(yǎng)情況

5. 微組織生物墨水的體內(nèi)軟骨再生情況
為了探究微組織生物墨水體內(nèi)再生軟骨的效果，作者分別打印了4組耳型支架：單純GelMA組、GelMA+軟骨細胞組、GelMA+CAM微載體組和GelMA+微組織組，埋入裸鼠皮下進行體內(nèi)實驗。6周和12周后取材，結(jié)果顯示，除GelMA+CAM微載體組外，其余三組支架均保有完好的耳型（圖8B）。將各組支架進行冰凍切片并組織學(xué)染色，其中GelMA+軟骨細胞組和GelMA+微組織組均可見再生的軟骨成分。在第12周時，微組織組中的軟骨細胞大面積增殖、膠原蛋白成片分布，明顯優(yōu)于GelMA+軟骨細胞組，軟骨相關(guān)基因COL2A1和Aggrecan的表達水平也更高。

圖8 體內(nèi)實驗驗證耳支架內(nèi)的軟骨再生情況

作者對四組支架進行抗人LaminA/C的免疫熒光染色，以確定再生細胞的來源（圖9）。結(jié)果顯示，GelMA+軟骨細胞組和GelMA+微組織組中的細胞基本為人源細胞，說明由植入的人殘耳軟骨細胞增殖而來，從而為日后的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

圖9 抗人Lamin A/C免疫熒光染色圖像鑒定細胞來源

近年來3D生物打印技術(shù)發(fā)展迅速，在組織工程中得到廣泛應(yīng)用。隨著印刷技術(shù)的不斷發(fā)展，生物墨水的優(yōu)化變得越來越重要。然而，大多數(shù)生物墨水是通過直接混合細胞和水凝膠溶液來進行打印的。這種方法使細胞在水凝膠中處于單細胞狀態(tài)，不能及時建立有效的細胞間連接，影響細胞外基質(zhì)的分泌。在本項工作中，作者開發(fā)了一種基于微組織的生物墨水來克服上述限制。將殘耳軟骨細胞與軟骨脫細胞基質(zhì)（CAM）微載體結(jié)合構(gòu)建軟骨微組織，可模擬細胞三維生長微環(huán)境，及時建立細胞間連接。將微組織與GelMA混合制備的生物墨水可通過投影式光固化3D打印技術(shù)加工成高彈性、高打印精度和低溶脹率的耳支架。體外長期培養(yǎng)后可見大量細胞外基質(zhì)沉積，裸鼠皮下植入12周可觀察到大量成熟軟骨再生。這種軟骨微組織生物墨水具有良好的生物相容性和力學(xué)性能，為生物墨水的優(yōu)化提供了新的思路，為小耳畸形患者的治療帶來了新的希望。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202201877