浙大楊華勇院士團(tuán)隊 | 多工藝多材料同步新型生物3D打印方法

來源：生物設(shè)計與制造BDM


本文來自本刊主編浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院楊華勇院士團(tuán)隊，介紹了一種可實現(xiàn)多工藝多材料同步構(gòu)建的新型生物3D打印方法，該方法可以支持多種生物材料的同步沉積打印。本研究提出的多材料生物制造方法非常靈活，可適用于基于天然生物材料、合成生物材料、細(xì)胞聚集體或復(fù)合材料的生物墨水，并能準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)異質(zhì)組織的復(fù)雜組成。模塊化的噴頭設(shè)計增加了組合打印方法的靈活性，可以將擠出式、噴墨式、光固化式、靜電紡絲等多種打印技術(shù)融合到打印過程中，也可根據(jù)制造精度或所選生物材料的要求進(jìn)行個性化定制。利用上述功能完備的混合生物3D打印系統(tǒng)，可以實現(xiàn)在同一打印平臺上構(gòu)建無法用單一工藝打印的復(fù)雜異質(zhì)組織或器官。

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2022-7-4 15:18 上傳

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生物3D打�。河行�構(gòu)建仿生組織和器官的技術(shù)
生物3D打印是生物制造領(lǐng)域的一項重要技術(shù)，旨在創(chuàng)建功能性仿生結(jié)構(gòu)。靈活自由、豐富多樣且功能全面的生物3D打印技術(shù)通過將細(xì)胞、生物材料或生長因子組裝成生物墨水來制造復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)[1,2]。傳統(tǒng)的生物3D打印技術(shù)現(xiàn)在面臨著諸多挑戰(zhàn)，包括打印水凝膠結(jié)構(gòu)整體機(jī)械穩(wěn)定性與構(gòu)建體的生物微環(huán)境仿生程度和打印組織/器官的血管化等問題�？蒲腥藛T已經(jīng)普遍意識到，僅用單一材料構(gòu)建功能齊全的組織/器官是不現(xiàn)實的。天然組織器官的復(fù)雜生物材料組成和細(xì)胞多樣性，使得單一材料生物3D打印技術(shù)無法滿足其體外構(gòu)建的需求[3]。

多材料生物3D打印
為解決當(dāng)前遇到的困難，多材料生物3D打印是一種簡單明了的方法，能夠構(gòu)建含多種材料與細(xì)胞的異質(zhì)結(jié)構(gòu)，可以更好地模擬天然組織/器官。對于目前最常見的生物3D打印方法，包括擠出、噴墨和光輔助打印，國際上各研究組已經(jīng)進(jìn)行了一些多材料打印的嘗試，業(yè)內(nèi)著名學(xué)者美國Terasaki生物創(chuàng)新研究所的Ali Khademhosseini等人對此已經(jīng)進(jìn)行過總結(jié)和討論[4,5]。目前的多材料擠出打印和噴墨打印具有簡單直接和材料切換速度相當(dāng)快的優(yōu)點，但它們限于生物墨水本身的流變學(xué)性質(zhì)，對生物材料的選擇有所局限。光輔助技術(shù)分辨率高，但多種材料切換需要復(fù)雜的機(jī)制，花費相對較長的時間，并且適用的生物墨水需要在可能具有細(xì)胞毒性的光引發(fā)劑的輔助下才能交聯(lián)。在異質(zhì)結(jié)構(gòu)中整合具有不同性質(zhì)的生物墨水仍然是生物3D打印功能化的組織/器官目前遇到的重要挑戰(zhàn)，亟需更先進(jìn)的制造技術(shù)提供支撐。

多工藝融合打印
采用單一工藝進(jìn)行生物制造很難突破各種生物墨水材料帶來的限制。為了充分發(fā)揮不同生物材料的特性，將多種打印工藝結(jié)合到一個裝備平臺上是有意義的。而且復(fù)雜異質(zhì)組織器官具有宏-微-納復(fù)合拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，難以用一種打印手段對各級精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行完美呈現(xiàn)，因此我們需要將多種生物3D打印手段結(jié)合起來進(jìn)行制造，譬如集成擠出式打印的多重墨水適配性與噴墨式打印的精準(zhǔn)性可以對細(xì)胞和生物材料的空間分布進(jìn)行更好的調(diào)控�，F(xiàn)階段我們僅能找到很少的案例進(jìn)行過此類嘗試，包括數(shù)字光處理（DLP）和擠出、擠出與靜電紡絲的組合[6,7]，而這對于體外制造活性組織是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

為何我們要嘗試多材料同步構(gòu)建異質(zhì)結(jié)構(gòu)？
大多數(shù)多材料打印技術(shù)遇到的問題在于其很難在有限的時間（為保持生物材料活性）內(nèi)對復(fù)雜異質(zhì)組織進(jìn)行有效構(gòu)建。由于CAD建模、路徑規(guī)劃或裝備復(fù)雜度等各種挑戰(zhàn)，即使裝備了多個打印噴頭，現(xiàn)階段的打印設(shè)備也僅能做到同時打印多個重復(fù)結(jié)構(gòu)，或進(jìn)行序列式打印。我們認(rèn)為，在采用增材制造方法，層層堆疊進(jìn)行打印時，在同一層內(nèi)的不同細(xì)胞等活性生物因子應(yīng)同步進(jìn)行打印。這不僅可以極大地縮短打印時間，提高組織活性，還能促進(jìn)不同種材料之間的融合，提高所構(gòu)建組織的整體機(jī)械性能。

模塊化設(shè)計的同步打印平臺
為了提高構(gòu)建多層結(jié)構(gòu)的打印效率，國內(nèi)外的研究人員開發(fā)了一種兩個噴頭獨立控制的多軸笛卡爾系生物3D打印機(jī)和使用多個可以并行打印的六自由度（6-DOF）機(jī)器人構(gòu)建的生物3D打印裝備[8,9]。雖然這些方法能夠使用兩個噴頭同時進(jìn)行生物3D打印，但它們?nèi)狈κ褂酶�多打印方法同時進(jìn)行生物3D打印的能力。

為了解決當(dāng)前存在的難題，本研究設(shè)計了一種基于多個噴頭獨立控制的生物3D打印方法，該方法可以支持多個噴頭的同時打印。模塊化設(shè)計增加了組合打印方法的靈活性，可以根據(jù)制造精度或所選生物材料的要求進(jìn)行定制（如圖1所示）。本文提出的多材料生物制造方法非常靈活，適用于基于天然生物材料、合成生物材料、細(xì)胞聚集體或復(fù)合材料的生物墨水，并能準(zhǔn)確再現(xiàn)異質(zhì)組織的復(fù)雜組成。由于采用模塊化設(shè)計方法，同軸打印和嵌入式生物3D打印技術(shù)也可以輕松應(yīng)用從而實現(xiàn)更復(fù)雜的人體組織/器官的構(gòu)建。此外，還可以通過模塊化設(shè)計引入其他基于噴嘴的打印方式，如基于液滴的擠出、靜電紡絲等技術(shù)，以實現(xiàn)工藝融合的復(fù)合制造。

圖1 適用多材料(a)和多工藝(b)的生物3D打印混合制造系統(tǒng)示意圖

打印展示
利用上述功能強(qiáng)大的復(fù)合生物3D打印平臺，可以構(gòu)建一些單一方法無法打印的復(fù)雜異質(zhì)組織/器官。作為演示，使用所提出的基于多噴頭的多材料打印方法打印全層血管化皮膚補(bǔ)片模型和三層管狀類血管模型。如圖2a所示，設(shè)計的皮膚補(bǔ)片模型可以通過傳統(tǒng)擠出、同軸擠出、噴墨和基于光輔助的打印技術(shù)結(jié)合來制造。圖2ai-2aiv表示皮膚補(bǔ)片模型的真皮層、皮下血管、微血管層和表皮層的構(gòu)建�？梢园l(fā)現(xiàn)，構(gòu)建全層血管化皮膚補(bǔ)片模型所需的生物材料因?qū)佣�異，而本文的多材料生�?D打印技術(shù)能夠在合理的短時間內(nèi)準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)實際皮膚組織模型。

為了更好地驗證本研究提出的方法在多層管狀生物組織構(gòu)建中的優(yōu)勢，設(shè)計了一個直徑約800 µm的三層空心管模型（如圖2c所示）。三種不同的生物墨水分別用于構(gòu)建內(nèi)層、中間層和外層。如圖2d所示，基于多噴頭擠出的多材料生物3D打印技術(shù)構(gòu)建的三層管狀模型貼合緊密，在共聚焦顯微鏡下，內(nèi)外血管貼合良好，形態(tài)保持良好（圖2e）。

此外，本文對管狀模型進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)，可以觀察到，在構(gòu)建的模型中培養(yǎng)四天后，平滑肌細(xì)胞MOVAS保持高度活性（圖2f）。共聚焦顯微鏡顯示MOVAS可以均勻分布在管狀模型的表面。在高倍鏡下，這些細(xì)胞彼此緊密連接，形成肌肉細(xì)胞層（圖2g），這表明本研究的同步多材料生物3D打印方法擁有創(chuàng)建具有高細(xì)胞活性的多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)的能力。

圖2 多材料異質(zhì)生物組織的構(gòu)建: (a) 基于多噴嘴技術(shù)構(gòu)建的多層血管化皮膚補(bǔ)片模型的打印過程；(b) 打印生成的皮膚補(bǔ)片模型；(c) 三層管狀模型及其生物材料分布示意圖；(d) 顯微鏡下觀察的三層管狀模型（di），三層管狀模型的熒光粒子分布（dii）；(e) 共焦顯微鏡下觀察熒光粒子在管狀模型內(nèi)外層的分布；(f) 第四天平滑肌細(xì)胞MOVAS活/死染色；(g) 含平滑肌細(xì)胞MOVAS的局部血管模型三維共聚焦圖像（gi），高倍鏡下觀察到的MOVAS細(xì)胞（gii）

未來展望
隨著新打印技術(shù)的發(fā)展，多材料生物3D打印技術(shù)正在不斷發(fā)展中。在現(xiàn)有生物3D打印方法的基礎(chǔ)上，通過重新設(shè)計、多功能設(shè)備結(jié)合組裝從而形成擁有新的功能的復(fù)合打印技術(shù)。該技術(shù)還可以隨著打印技術(shù)的發(fā)展，根據(jù)需要更換打印單元。目前，人體組織構(gòu)建的制造技術(shù)已經(jīng)有兩種組合，一種是基于擠出和噴墨技術(shù)的復(fù)合制造方法用于皮膚打印，另一種是基于光固化和擠出的復(fù)合制造技術(shù)，用于構(gòu)建含細(xì)胞的水凝膠結(jié)構(gòu)�？梢灶A(yù)見，在未來的多材料生物3D打印領(lǐng)域，微擠壓、噴墨、立體光刻和基于微流控的生物3D打印等多種工藝的復(fù)合制造將是主要趨勢之一。

除了過程中的復(fù)合制造，多材料生物3D打印技術(shù)還可以通過使用更先進(jìn)的材料來得到進(jìn)一步發(fā)展，利用自組裝材料實現(xiàn)含細(xì)胞精細(xì)微結(jié)構(gòu)或生物特異性組織。研究表明，使用自愈性懸浮液可以更自由地在液體中構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)。此外，多材料生物3D打印可以通過犧牲墨水材料、實現(xiàn)多層管狀血管的構(gòu)建，以及引入刺激響應(yīng)材料作為生物墨水來實現(xiàn)4D打印在生物制造中的集成，從而改進(jìn)當(dāng)前的單一材料設(shè)計。

我們相信，通過這種復(fù)雜的同步多材料多工藝生物3D打印，最終可以以相對較高的打印效率，打印出含有不同組分細(xì)胞和精細(xì)微觀結(jié)構(gòu)的全功能異質(zhì)組織/器官，從而實現(xiàn)用于組織/器官移植的目標(biāo)。