基于載微球的絲素蛋白墨水3D打印構(gòu)建具有氧氣釋放和免疫調(diào)控功能的血管化心肌補(bǔ)片

來(lái)源：生物打印與再生工程  

急性心肌梗塞發(fā)生之后，受損的心肌組織失去心肌細(xì)胞并形成纖維疤痕組織，這會(huì)加重局部健康心肌細(xì)胞的負(fù)荷，進(jìn)一步損壞心肌功能。目前，由組織工程技術(shù)構(gòu)建的心肌補(bǔ)片是一種具有潛力心肌修復(fù)工具。理想的心肌補(bǔ)片應(yīng)當(dāng)具有與心肌組織相匹配的力學(xué)特性和導(dǎo)電性，同時(shí)要有良好的生物相容性。

印度理工學(xué)院瓜哈提分校生物科學(xué)工程系的Biman B. Mandal等人在ACS Materials and Interfaces雜志發(fā)表了題為“Engineering Microsphere-Loaded Non-mulberry Silk-Based 3D Bioprinted Vascularized Cardiac Patches with Oxygen-Releasing and Immunomodulatory Potential”的文章。研究者使用絲基生物墨水封裝內(nèi)皮細(xì)胞，打印了血管化組織工程支架，通過(guò)摻雜碳納米管使其具備了一定導(dǎo)電性。之后在支架內(nèi)種植心肌細(xì)胞，灌注裝載白細(xì)胞介素-10(IL-10)的明膠甲基丙烯酰基微球和過(guò)氧化鈣，從而保證補(bǔ)片植入后局部的微環(huán)境中有足夠氧氣促進(jìn)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的存活，同時(shí)釋放出的 IL-10因子可以使原位巨噬細(xì)胞極化為抗炎M2表型，改善其植入后的免疫反應(yīng)。

背景介紹
近年來(lái)，使用組織工程技術(shù)制造的功能化心肌補(bǔ)片已經(jīng)逐漸顯示出了臨床應(yīng)用價(jià)值，另一方面，生物3D打印技術(shù)也為構(gòu)建復(fù)雜的異質(zhì)微環(huán)境提供新的方法。研究者基于已報(bào)道的部分工作，使用包含非桑蠶絲素蛋白 (nSF)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 (PEGDMA) 和 GelMA 聚合物 (SPG) 的生物墨水封裝內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)3D打印技術(shù)制備了各向異性的血管化心肌組織補(bǔ)片，并通過(guò)摻雜碳納米管 (CNT)改善補(bǔ)片中心肌細(xì)胞電生理信號(hào)的傳導(dǎo)。該補(bǔ)片經(jīng)過(guò)一定時(shí)間灌注培養(yǎng)后植入了新生大鼠心肌細(xì)胞，最終使其成為具有天然組織排布且能夠同步收縮的心肌補(bǔ)片。

為了能夠使補(bǔ)片在植入宿主體內(nèi)后快速整合，增強(qiáng)局部的細(xì)胞活力并改善組織功能，減小損傷和炎癥反應(yīng)。研究人員進(jìn)一步將帶有過(guò)氧化鈣和白細(xì)胞介素-10的GelMA微球加入了心肌補(bǔ)片之中，這樣緩釋出的氧氣有助于改善植入后內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的活力，同時(shí)IL-10因子也可以減小炎癥反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
1.導(dǎo)電生物墨水
該生物墨水主要由非蠶絲來(lái)源的絲素蛋白、PEGDMA、GelMA混合而成。通過(guò)超聲分散3mg/ml 碳納米管增強(qiáng)其導(dǎo)電性，在添加了光引發(fā)劑之后就可通過(guò)紫外固化成型。同時(shí)墨水內(nèi)還添加了10 mM HRP 和 0.9% v/v H 2 O 2，用于分散以及形成微纖維結(jié)構(gòu)。墨水中PEGDMA可以改善其打印時(shí)穩(wěn)定性，同時(shí)GelMA具有不錯(cuò)的生物相容性。

圖1 導(dǎo)電墨水具有剪切變稀的流變特性，使用3D打印設(shè)備預(yù)成型后通過(guò)紫外光進(jìn)行交聯(lián)。

2.預(yù)血管化補(bǔ)片的制備與表征
該支架通過(guò)使用生物3D打印的方式進(jìn)行制造，通過(guò)設(shè)計(jì)每一層不同的絲間距，形成了以三層為一個(gè)單元的籠形支架結(jié)構(gòu)。該支架結(jié)構(gòu)與心肌纖維的結(jié)構(gòu)相似，且力學(xué)特性與心肌組織的細(xì)胞外基質(zhì)相似。將直流電通過(guò)樣品來(lái)評(píng)估 3D 打印結(jié)構(gòu)的電導(dǎo)率， 與不摻雜CNT的生物材料墨水 ( R = 129.7 ± 4.37 kΩ) 相比，摻雜后( R = 93.6 ± 7.3 kΩ) 的電阻值較低，表明在生物墨水中添加 CNT 后電導(dǎo)率增加。

圖2 支架整體呈各向異性，摻雜CNT之后其電導(dǎo)率明顯提升。

使用封裝有內(nèi)皮細(xì)胞的生物墨水進(jìn)行生物3D打印，之后放入特定的生物反應(yīng)器以4 μl /min的流速灌注培養(yǎng)基。在灌注微生物反應(yīng)器中成熟后第 14 天對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，可以看到內(nèi)皮細(xì)胞之間連接緊密。定量檢測(cè)顯示其DNA含量增加了4.2倍。

圖3 使用封裝有內(nèi)皮細(xì)胞的生物墨水打印支架，灌流的模擬如圖C所示，灌流十四天后使用熒光免疫染色觀察細(xì)胞形態(tài)。

3.心肌細(xì)胞植入、電刺激訓(xùn)練及表征
將新生大鼠原代心肌細(xì)胞接種到放置在疏水性 PDMS 表面上的生物打印支架上，通過(guò)DNA定量檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)。對(duì)比不摻雜CNT的生物支架，該生物支架的DNA相對(duì)較少，研究人員推測(cè)是CNT抑制了成纖維細(xì)胞的增殖。通過(guò)對(duì)F-肌動(dòng)蛋白染色，可以看到心肌細(xì)胞沿著各向異性的微纖維結(jié)構(gòu)均勻分布。

圖4 支架植入心肌細(xì)胞后的生物學(xué)表征，免疫熒光染色結(jié)果顯示，導(dǎo)電支架上心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物含量更高。

研究人員還使用特定的電刺激裝置對(duì)該結(jié)構(gòu)進(jìn)行了1Hz的電刺激訓(xùn)練，七天后對(duì)心臟特異性標(biāo)志物連接蛋白、原肌球蛋白和 F-肌動(dòng)蛋白 ( n = 6) 進(jìn)行免疫染色，用于評(píng)估心肌組織的功能性。結(jié)果顯示摻雜CNT的支架中，細(xì)胞的跳動(dòng)頻率更高且跳動(dòng)更加均勻，并且經(jīng)過(guò)電刺激訓(xùn)練后的心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率也有更進(jìn)一步提升。

圖5 支架內(nèi)心肌組織的功能性評(píng)估，相比對(duì)照組，導(dǎo)電支架上心肌的跳動(dòng)頻率更高且均勻。

4.氧氣及IL-10因子緩釋
為了改善該補(bǔ)片植入后的效果，研究人員使用微流控技術(shù)將過(guò)氧化鈣封裝在約200-250 μm的GelMA微球中，與空白組相比，微球可以在起初的4-5天維持局部的富氧環(huán)境。微球制備使用特制的同軸噴頭，具體參數(shù)如下：
外相：杏仁油，流速為 2500 μL/min；
內(nèi)相：7.5% w/v CPO-GelMA、1% w/v LAP，流速50 μL/min；
光源：405 nm，1000 mW；
光照時(shí)間：20s。

圖6 緩釋微球的制備流程，如（B）中所示，微球中在前五天內(nèi)穩(wěn)定釋放氧氣。

IL-10-GelMA微球制作工藝與CPO-GelMA相似，使用上述微流控參數(shù)，內(nèi)相為7.5% w/v GelMA、1% w/v LAP。制得微球后凍干，與 IL-10 溶液在4℃下孵育24 h。將帶有 IL-10因子的微球與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以看出帶有IL-10因子的GelMA微球可以明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，這意味著可以明顯降低局部的促炎因子分泌。

圖7  IL-10-GelMA 微球?qū)θ祟惥奘杉?xì)胞有免疫調(diào)節(jié)作用，免疫染色結(jié)果表明其釋放的IL-10可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為 M2 表型。

總結(jié)
該研究使用了多種組織工程技術(shù)，通過(guò)生物3D打印制造籠形導(dǎo)電心肌支架，在生物反應(yīng)器內(nèi)灌注促進(jìn)內(nèi)皮形成血管化結(jié)構(gòu)，之后電刺激誘導(dǎo)支架內(nèi)心肌細(xì)胞成熟，隨后在支架內(nèi)放入由微流控裝置制造的藥物緩釋微膠囊，構(gòu)建出一種集導(dǎo)電、載細(xì)胞、藥物/氧氣緩釋于一體的血管化心肌補(bǔ)片材料。

參考文獻(xiàn)：
Shreya Mehrotra, Rishabh Deo Singh, et al. Engineering Microsphere-Loaded Non-mulberry Silk-Based 3D Bioprinted Vascularized Cardiac Patches with Oxygen-Releasing and Immunomodulatory Potential. ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 43, 50744–50759
https://doi.org/10.1021/acsami.1c14118