《AFM》3D 打印 “腸” 奇跡：構建三培養(yǎng)管狀網狀人工腸

來源：EFL生物3D打印與生物制造

先天性腸道閉鎖或狹窄等疾病常需手術干預，但對于胎兒或兒科患者，手術切除可能引發(fā)短腸綜合征，進而需要器官移植。然而，胎兒供體短缺限制了器官的可獲取性，因此開發(fā)類器官再生療法和人工器官迫在眉睫。在人工腸道的研究中，盡管3D生物打印技術取得了一定進展，但此前的研究多聚焦于腸道內壁部分結構的構建或藥物吸收模型的開發(fā)，無法充分模擬天然腸道的完整結構和功能。已有的方法在容納細胞類型、機械性能以及促進細胞間相互作用等方面存在不足，難以滿足實際移植需求。  

來自韓國機械與材料研究所、忠南國立大學和韓國生物科學與生物技術研究所的Seok-jo Yang教授和Junhee Lee教授團隊合作開展研究。他們利用混合3D打印技術，構建了一種三培養(yǎng)管狀網狀腸道（TTMI），整合了肌成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞。該團隊通過使用低濃度的明膠甲基丙烯酰（GelMA）生物墨水提高細胞活力，采用雙冷卻模塊改善打印性能，并運用多頭四軸生物打印機增強支架的機械性能。相關工作以“Hybrid 3D-Printed Tri-Cultured Intestine with Tubular Mesh Structure”為題發(fā)表在《Advanced Functional Materials》上，為人工腸道的發(fā)展提供了新的方向，有望推動組織工程和再生醫(yī)學領域的進步。

研究內容
1. 用于TTMI的多頭3D打印系統(tǒng)開發(fā)，通過構建先天性腸道閉鎖或狹窄胎兒的人工腸移植模型，利用多頭四軸可控3D生物打印機及加熱、冷卻模塊進行實驗，研究了TTMI的設計、構建過程以及細胞在其中的分布和相互作用。結果表明，成功設計并制備出具有四層結構、包含三種細胞類型的TTMI，其結構穩(wěn)定性良好，細胞間能有效相互作用，模擬了天然腸道的部分結構和功能。

圖1. 用于TTMI的多頭3D打印系統(tǒng)開發(fā)。  

2. PCL管狀網的機械性能，使用萬能測試機和特定夾具對不同網格間距的PCL管狀網進行拉伸測試，測量其應力 - 應變曲線、彈性恢復率等指標。研究了PCL管狀網的拉伸強度、屈服強度、彈性模量以及彈性恢復率與網格間距的關系。結果顯示，隨著網格間距從0.6mm增加到2.0mm，拉伸強度、屈服強度和楊氏模量降低；網格間距為1.0mm和1.2mm時各項性能表現(xiàn)相似；彈性恢復率在網格間距為1.0mm時較好，綜合考慮選擇1.0mm網格間距制備管狀網。

圖2. PCL管狀網的機械性能。  

3. 使用雙冷卻模塊打印低濃度GelMA，運用旋轉流變儀測量GelMA的流變特性，通過COMSOL模擬和實際測量溫度，研究了不同濃度GelMA在不同溫度下的溶膠 - 凝膠轉變行為，以及雙冷卻模塊對低濃度GelMA打印的影響。結果表明，不同濃度GelMA的溶膠 - 凝膠轉變溫度不同，雙冷卻模塊能有效維持2%和3% GelMA的凝膠狀態(tài)，確保管狀生物打印的形狀保真度，并得出了不同濃度GelMA打印的最佳溫度和時間條件。

圖3. 使用雙冷卻模塊打印低濃度GelMA。  

4. 優(yōu)化GelMA濃度以提高打印性和細胞活力，將HUVECs和CCD - 18Co細胞分別封裝在不同濃度GelMA中進行打印，利用熒光顯微鏡觀察細胞活性和形態(tài)，通過CCK - 8實驗檢測細胞增殖情況。研究了不同濃度GelMA對兩種細胞的活力、增殖和分化的影響。結果顯示，2% GelMA有利于HUVECs的增殖和維持形態(tài)，3% GelMA對CCD - 18Co細胞的增殖和分化最為有利，因此分別選擇2%和3% GelMA用于封裝這兩種細胞。

圖4. 優(yōu)化GelMA濃度以提高HUVECs和CCD - 18Co細胞的打印性和活力。  

5. CCD - 18Co和Caco - 2細胞在TTMI中的相互作用，將Caco - 2細胞和CCD - 18Co細胞分別接種或共接種在3% GelMA打印的PCL管狀網上，運用熒光顯微鏡觀察細胞存活和生長情況，通過CCK - 8實驗檢測細胞增殖，用堿性磷酸酶（ALP）和DNA檢測評估細胞分化，借助掃描電子顯微鏡（SEM）觀察微絨毛。研究了兩種細胞在TTMI中的相互作用對細胞增殖和分化的影響。結果表明，兩種細胞共培養(yǎng)促進了Caco - 2細胞的增殖和分化，PCL管狀網有助于細胞間相互作用。

圖5. CCD - 18Co和Caco - 2細胞的相互作用促進腸上皮生長。  

6. TTMI的生物學特性，對含有三種細胞的TTMI進行細胞追蹤、組織學染色、免疫染色和跨內皮電阻（TEER）測量等實驗，研究了TTMI中細胞的增殖、分化、定位以及上皮膜形成情況。結果表明，TTMI中三種細胞類型的排列與天然腸道相似，細胞增殖和分化良好，細胞間相互作用促進了上皮膜的形成，證明TTMI可作為體外模型模擬腸道的部分功能。

圖6. TTMI的生物學特性。

研究結論
本研究構建了一種模仿人類胎兒腸道結構和細胞組成的三培養(yǎng)管狀網狀腸道（TTMI），這是人工腸道發(fā)展的重要進展。研究將人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）、人正常結腸成纖維細胞（CCD - 18Co）和人結直腸腺癌細胞（Caco - 2）整合到人工腸道中，發(fā)現(xiàn)其可支持細胞增殖、分化并形成功能性腸屏障，證實了三培養(yǎng)技術在組織工程中開發(fā)可植入材料的適用性。通過結合多頭3D生物打印機與混合打印技術、旋轉接種板、四軸控制系統(tǒng)以及加熱和雙冷卻模塊，成功制備出TTMI。該模型細胞增殖和分化率高，細胞間相互作用促進了上皮細胞分化和上皮膜形成。不過，TTMI模型仍需體內驗證。此外，4D形狀記憶技術的發(fā)展可能有助于提升其植入后的機械強度和彈性恢復能力。TTMI為研究腸道生理、藥物吸收和疾病建模提供了有用平臺，在再生醫(yī)學和個性化移植治療方面具有潛在應用價值。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202424495