基于脫細(xì)胞基質(zhì)生物墨水的3D打印真皮研發(fā)新成果

來(lái)源：上普生物

背景介紹

燒傷作為第四大最常見(jiàn)的皮膚創(chuàng)傷誘因，除休克和敗血癥外，皮膚創(chuàng)傷處繼續(xù)生長(zhǎng)和收縮的瘢痕也是燒傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，它不僅會(huì)損害患者的外貌，還會(huì)嚴(yán)重影響患者的生理及心理健康。防止瘢痕收縮最先進(jìn)手段包括早期移植或皮瓣轉(zhuǎn)移。然而，此類(lèi)治療可能會(huì)導(dǎo)致供體或皮瓣部位瘢痕攣縮，并且常常受到皮膚/皮瓣來(lái)源不足等因素制約。因此，臨床實(shí)施困難重重。雖然已有部分研究報(bào)道結(jié)合3D打印及生物墨水制備皮膚類(lèi)似物用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)并已取得很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但目前的研究大多集中在體外材料介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)， 而非宏觀的傷口愈合過(guò)程， 且該類(lèi)生物材料在抑制瘢痕攣縮方面的作用目前尚無(wú)足夠的證據(jù)和結(jié)論進(jìn)行支撐， 因此探索新型真皮材料的研發(fā)及復(fù)合生物3D打印技術(shù)將為提高患者皮膚創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量帶來(lái)新的希望。

近日，一篇名為“3D-printed dermis-specific extracellular matrix mitigates scar contraction via inducing early angiogenesis and macrophage M2 polarization”關(guān)于皮膚表面創(chuàng)傷修復(fù)的文章由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷外科祁少海教授研究團(tuán)隊(duì)和中山大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院陳永明教授團(tuán)隊(duì)共同在生物醫(yī)學(xué)1區(qū)及生物材料1區(qū)期刊Bioactive Materials發(fā)表。

該研究團(tuán)隊(duì)從具備多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的豬真皮細(xì)胞外基質(zhì)材料入手， 制備了可以高效保留豬真皮層細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的的生物活性粉末， 并利用此粉末制備了可供生物3D打印的溫敏墨水。該團(tuán)隊(duì)使用此墨水， 通過(guò)擠出式3D打印方式， 制備出了具有百微米級(jí)別空間構(gòu)型的皮膚真皮結(jié)構(gòu)類(lèi)似物（PDA）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該3D打印制備的真皮類(lèi)似物具有良好的生物相容性， 可有效促進(jìn)植皮后的早期血管化， 更有意義的是能夠通過(guò)調(diào)節(jié)皮膚再生相關(guān)基因的表達(dá)從而有效抑制植皮創(chuàng)面攣縮而帶來(lái)的瘢痕影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 豬真皮細(xì)胞外基質(zhì)超細(xì)粉末（dECM）的制備與表征

首先，通過(guò)DAPI、Massons染色和甲苯胺藍(lán)染色等實(shí)驗(yàn)方法證明可通過(guò)機(jī)械破碎方式獲得具有組織特異性的超微細(xì)胞外基質(zhì)粉末和影響局部細(xì)胞行為的功能性分子， 如糖胺聚糖（GAGs）等。

2. 利用3D打印技術(shù)制備體外皮膚類(lèi)似物（PDA）

通過(guò)流變學(xué)測(cè)試優(yōu)化并確定了包括打印溫度（18-20°C），墨水濃度（8.5wt%），打印速率（50mm/min）在內(nèi)的打印參數(shù)，利用3D打印方式制備體外皮膚類(lèi)似物（PDA）。3D打印構(gòu)建的類(lèi)皮膚結(jié)構(gòu)經(jīng)戊二醛交聯(lián)后進(jìn)行了體外降解及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)化學(xué)交聯(lián)的PDA在體外降解56天時(shí)依然保持良好的結(jié)構(gòu)完整性。通過(guò)在PDA表面接種L929成纖維細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞活/死染色和MTT檢測(cè)均證明此PDA具有良好的生物相容性。

3. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)-皮膚傷口移植收縮評(píng)估

使用大鼠全皮層創(chuàng)傷模型評(píng)價(jià)PDA對(duì)分層厚皮移植（STSG）中傷口愈合及收縮的評(píng)估。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明PDA在減少疤痕收縮和促進(jìn)傷口愈合效果方面優(yōu)于作為陽(yáng)性對(duì)照 （PL）的售類(lèi)真皮產(chǎn)品Pelnac。

4. 皮膚移植物術(shù)后變化及基因分析

通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)采集的皮膚移處切片經(jīng)組織染色表征，發(fā)現(xiàn)PDA可有效減輕傷口纖維化，并在促進(jìn)膠原沉積成熟的同時(shí)對(duì)受損毛囊、皮脂腺等附屬器官也有一定的修復(fù)。與此同時(shí)，通過(guò)對(duì)代謝和信號(hào)通路基因追蹤發(fā)現(xiàn)并確定了PL組和PDA組動(dòng)物創(chuàng)傷表型的差異是由材料介導(dǎo)的創(chuàng)傷細(xì)胞在遺傳水平上的一系列變化引起的。

5. 皮膚移植血管新生分析

研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚植入早期，功能性的新血管產(chǎn)生與移植皮膚類(lèi)似物的正常機(jī)理維持有關(guān)，新血管的形成可以防止瘢痕形成和相關(guān)部委皮膚收縮。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)鏡下觀察移植物周邊微血管密度和相關(guān)基因數(shù)據(jù)判斷移植物植入術(shù)后的存活情況。在術(shù)后，PDA組微血管數(shù)呈現(xiàn)先增加后減緩的趨勢(shì)，與此同時(shí)，誘導(dǎo)新血管生成，且能促進(jìn)肝纖維化的Grem1基因檢測(cè)顯示PL組中參與新血管形成的相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)基因呈上調(diào)趨勢(shì)，與組織學(xué)結(jié)果一致。

6. 手術(shù)部位巨噬細(xì)胞極化

皮膚受傷后會(huì)引起一系列的炎癥反應(yīng)，在所有參與這一反應(yīng)的免疫細(xì)胞中，m表型(M1趨向M2)的轉(zhuǎn)化不僅是傷口修復(fù)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵條件，也是材料-新生組織整合及瘢痕形成的關(guān)鍵因素。通過(guò)免疫組化CD68、CRR7、CD163對(duì)各區(qū)段的巨噬細(xì)胞m 表型進(jìn)行免疫染色評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自第14天起，PDA移植創(chuàng)面中M2比例明顯高于IS和PL移植創(chuàng)面，表明的傷口有助于為再上皮化和從肉芽組織發(fā)育為特征的修復(fù)階段向穩(wěn)定階段過(guò)渡。

結(jié)論

本文報(bào)道了一種新穎的用豬真皮脫細(xì)胞基質(zhì)3D打印組裝PDA移植物的抗瘢痕方法，移植PDA可以顯著減少創(chuàng)面收縮和瘢痕形成， 同時(shí)PDA植入組表現(xiàn)出高效的早期血管重建，巨噬細(xì)胞向M2表型的極化增強(qiáng)，皮膚功能保存較好的修復(fù)效應(yīng)，其修復(fù)結(jié)果與正常皮膚形態(tài)學(xué)相似。本研究通過(guò)分子生物學(xué)進(jìn)一步闡述了移植物在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)、瘢痕形成上的基因調(diào)控機(jī)理， 同時(shí)未來(lái)生物材料對(duì)皮膚抗瘢痕特性的改善及其臨床可譯性奠定了一定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

Chen L, Li Z, Zheng Y, Zhou F, Zhao J, Zhai Q, et al. 3D-printed dermis-specific extracellular matrix mitigates scar contraction via inducing early angiogenesis and macrophage M2 polarization. Bioactive Materials 2022;10:236-46.

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.09.008