基于微流控制備載細胞核-殼結(jié)構(gòu)微凝膠的3D打印骨再生結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

來源： EngineeringForLife  

利用3D生物打印技術(shù)制備載細胞組織結(jié)構(gòu)時，打印過程中的剪切應力顯著降低了生物活性。已有研究證明，具有獨立控制隔室的微凝膠可以在打印過程中保護細胞。

近期，東華大學化學化工與生物工程學院和材料科學與工程學院的何創(chuàng)龍教授團隊和周小軍老師聯(lián)合復旦大學附屬浦東醫(yī)院骨科的何家文醫(yī)生提出利用基于微流控技術(shù)制備的核-殼結(jié)構(gòu)的微凝膠封裝細胞，以減少擠出生物3D打印過程中剪切應力對細胞的損傷，并在骨組織修復領(lǐng)域具有良好的應用前景。相關(guān)論文“Construction of 3D printed constructs based on microfluidic microgel forbone regeneration”發(fā)表于雜志Composites Part B上。

圖1 載細胞微凝膠和 3D 打印載細胞微凝膠的制造過程示意圖

1. 微流控制備核-殼結(jié)構(gòu)的載細胞微凝膠

參數(shù)
油相：含有1v/v%司班80、0.01v/v%乙酸和0.8w/v% CaCl2-NP的液體石蠟
殼：2%w/v的海藻酸鈉和50 mM Ca-EDTA混合溶液
核：含有GFP-BMSCs cells/mL的I型膠原溶液
流速：水相Qaqu /油相Qoil = 1/3，核相 Q1/殼相Q2 = 2

微凝膠制備過程（圖1）
將核心溶液和殼溶液分別裝入無菌微流控注射器的中間和兩側(cè)的注射器中，流速由注射泵獨立控制，在微流體平臺上制備載有細胞的微凝膠；然后，在收集過程中，使用PBS溶液（pH = 7.4）中和油相中的乙酸溶液；最后，將載有細胞的微凝膠重新懸浮在細胞培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)。


表征
乙酸和 CaCl2 -NP濃度與微凝膠形態(tài)的關(guān)系：當 CaCl2-NP的濃度為0.8wt % 時，0.01 v/v%的乙酸溶液即可形成粒徑均勻的微凝膠（圖2）。

流速與微凝膠的粒徑分散性和殼核結(jié)構(gòu)的關(guān)系：粒徑分散性隨著流速比Qaqu/Qoil的減小而減小，尺寸也相應減小（圖2）；I型膠原相 (Q 1 )流速增加，核層厚度增加，殼層厚度相應減�。▓D3）。
醋酸濃度和Qaqu/Qoil的流速比對載細胞微凝膠細胞活力的影響（圖4）：隨著乙酸濃度的降低和流速比的增加，細胞活力相應增加；使用這些參數(shù)制備的微凝膠具有良好的生物相容性。

圖2 乙酸、CaCl2 -NP濃度和流速對微凝膠形態(tài)的關(guān)系圖

圖3 流速與微凝膠殼-核的關(guān)系圖

圖4 載細胞微凝膠中細胞活力圖

2. 3D載微凝膠結(jié)構(gòu)的生物打印
打印參數(shù)
噴嘴內(nèi)徑為500 μm；
層高0.55mm，網(wǎng)格填充寬度1mm，軸速度3mm/s，氣壓值0.25 MPa；
墨水預處理溫度4℃。


打印過程
將生物3D打印機放置在無菌室中，以確保打印過程的無菌性。2 mL載細胞微凝膠（5×10^5個細胞）與SilMA/GelMA 復合材料混合作為3D生物打印的生物墨水。為確保細胞數(shù)的一致性，將2 mL培養(yǎng)基（5×10^5個細胞）加入到不含微凝膠的bioink中作為對照組進行生物打印。3D打印體在UV照下（365nm，10秒）進行光交聯(lián)，并轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。


表征：
微凝膠結(jié)構(gòu)對細胞活力的影響：3D打印的載細胞微凝膠結(jié)構(gòu)的細胞活力高于載細胞3D打印結(jié)構(gòu)，微凝膠在打印過程中對細胞的保護作用。

圖5 3D打印結(jié)構(gòu)體的細胞增殖圖

3. 3D打印結(jié)構(gòu)促進骨組織再生
炎癥反應：將Microgel-15%SilMA/GelMA和15%SilMA/GelMA 構(gòu)建體置于 SD 大鼠的皮下，材料與組織界面周圍未觀察到明顯的炎癥反應，適合體內(nèi)植入。

骨缺損修復效果：將載有細胞的構(gòu)建體置SD大鼠的顱骨缺損處，micro-CT、BMD及H&E 染色結(jié)果表明Microgel-15%SilMA/GelMA比15%SilMA/GelMA相比，可明顯促進BMSCs的增殖和體內(nèi)骨再生。

圖6 皮下植入3D 打印結(jié)構(gòu)體1周和2周后的H&E 和 Masson 染色

圖7 評估體內(nèi)骨再生圖

總之，研究者證明了使用微凝膠封裝細胞減少打印過程中的細胞損傷、增強細胞活力策略的可行性。同時表明，嵌入微凝膠的SilMA/GelMA具有良好的生物相容性，具有成為用于3D 生物打印的多功能生物墨水的潛力。

參考文獻

Ningwen Chai，Jingtian Zhang，Qianqian Zhang ，Haibo Du，Xi He，Jin Yang，Xiaojun Zhou，Jiawen He，Chuanglong He. Construction of 3D printed constructs based on microfluidic microgel for bone regeneration. Composites Part B
https://doi.org/10.1016/j.compositesb.2021.109100