多室水凝膠纖維誘導(dǎo)細(xì)胞組織定向

來(lái)源：EngineeringForLife

大多數(shù)組織中的細(xì)胞在空間分布和排列上都表現(xiàn)出高度的組織性，這種有組織的結(jié)構(gòu)對(duì)于成熟過(guò)程中細(xì)胞的正常發(fā)育和成熟組織的功能至關(guān)重要。因此，用于組織工程應(yīng)用的生物制造細(xì)胞支架折疊需要模仿這種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以復(fù)制自然組織的行為。在組織工程支架的制造中，將具有細(xì)胞大小分辨率的理化線索融入三維支架中以引導(dǎo)所需的細(xì)胞組織則仍十分具有挑戰(zhàn)性。University of Connecticut Health Center的Ali Tamayol課題組在Applied Physics Reviews上發(fā)表了題為“Controlling cellular organization in bioprinting through designed 3D microcompartmentalization”的論文，研究報(bào)道了一種快速、簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)有效的方法，用于連續(xù)打印具有內(nèi)在三維微絲的多室水凝膠纖維，以控制細(xì)胞取向。這種策略可以很容易地應(yīng)用于各種基于纖維的組織工程方法，包括3D生物打印和生物編織品制造，控制細(xì)胞組織，促進(jìn)更多仿生結(jié)構(gòu)的生物制造。

多室水凝膠纖維的制備工藝如圖1，打印噴頭主要是將靜態(tài)混合器集成到同軸擠出裝置中，用于打印具有圖形化內(nèi)部微形貌的海藻酸/ GelMA水凝膠纖維。海藻酸、GelMA兩相水凝膠在靜待混合器的多次分割下形成互相隔離的微纖維結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)同軸微流控裝置的內(nèi)部通道擠壓，并接觸鈣離子，形成藻酸鹽凝膠以及UV光固化來(lái)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。在設(shè)計(jì)的微結(jié)構(gòu)中，GelMA部分提供了有利于細(xì)胞的環(huán)境，而海藻酸提供了形態(tài)和機(jī)械支撐，引導(dǎo)細(xì)胞的方向。結(jié)果表明，微形貌的組織和細(xì)胞排列，可以通過(guò)控制打印過(guò)程中的流動(dòng)參數(shù)來(lái)定制。盡管宏觀纖維的直徑大于1mm，但精確調(diào)整的內(nèi)部微形貌成功誘導(dǎo)了細(xì)胞擴(kuò)散和對(duì)齊，這有助于細(xì)胞快速增殖和分化向成熟的生物結(jié)構(gòu)。

圖1 多室水凝膠纖維制造原理示意圖

靜態(tài)混合器與各階段的水凝膠纖維橫截面如圖2，靜態(tài)混合器由多個(gè)螺旋元件組成，在不同的方向上間歇扭轉(zhuǎn)，用于形成多螺旋結(jié)構(gòu)。如模擬所示，該裝置中的每個(gè)混合元件將混合流體切割成兩個(gè)子流。通過(guò)向混合器中注入兩種不同的溶液，流體被連續(xù)地分成更多的子流，形成不同條紋的陣列。并且可以通過(guò)控制靜態(tài)混合器中元件的數(shù)量，可以形成厚度和條紋數(shù)量可調(diào)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。同軸的通道結(jié)構(gòu)，則可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)外兩相液體的流速比例，準(zhǔn)確控制最終纖維尺寸。

圖2 多室水凝膠纖維相關(guān)表征

為驗(yàn)證該纖維結(jié)構(gòu)對(duì)形成細(xì)胞定向組織的影響，研究比較了在多室凝膠纖維中與在用預(yù)混合生物墨水制作的纖維中培養(yǎng)的成肌細(xì)胞的行為。盡管纖維的直徑(>1mm)比細(xì)胞大小大，但24小時(shí)后在多室凝膠纖維中觀察到高度對(duì)齊的細(xì)胞組織，而預(yù)混纖維包裹的細(xì)胞幾乎保持球形，如圖3。該結(jié)果可以通過(guò)以下方式來(lái)解釋：（1）細(xì)胞在藻酸鹽切片上和GelMA微絲中不同的擴(kuò)散傾向；（2）纖維內(nèi)部微結(jié)構(gòu)作為指導(dǎo)細(xì)胞排列的拓?fù)渚�索；（3）由于GelMA和藻酸鹽切片中的支架剛度差異，細(xì)胞受到不同機(jī)械刺激。

在細(xì)胞活性方面，GelMA區(qū)域的存在確保了細(xì)胞的擴(kuò)散和增殖。而在預(yù)混合凝膠結(jié)構(gòu)中，海藻酸鹽的存在導(dǎo)致支架無(wú)法降解，因此不能提供足夠的空間進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)散和增殖。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞的活性和增殖速度低于多室水凝膠纖維中的結(jié)果。

圖3 多室水凝膠纖維的細(xì)胞組織和代謝活性

通過(guò)設(shè)置不同的同軸流速比，可以調(diào)整細(xì)胞取向與纖維軸向的角度，如圖4。隨著流速比例的變化，可以對(duì)纖維內(nèi)的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行實(shí)時(shí)控制。

圖4 多室水凝膠纖維內(nèi)細(xì)胞組織取向的實(shí)時(shí)控制

基于纖維的生物制造方法可用于制造各向異性組織（如肌肉）的仿生支架。在生物工程支架中模擬這類組織的纖維結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)被包裹的細(xì)胞的行為以增強(qiáng)肌生成。為證明這個(gè)概念，研究驗(yàn)證了所提出的支持成肌細(xì)胞成熟的策略，如圖5。肌細(xì)胞迅速增殖、融合并形成多核肌管。在包封后第7天，水凝膠纖維被高度定向的密集排列的肌管完全占據(jù)，形成一個(gè)束狀結(jié)構(gòu)。多室水凝膠纖維中成肌標(biāo)志物的表達(dá)也表明細(xì)胞分化成熟并形成肌纖維。

圖5 多室水凝膠纖維作為肌肉組織工程支架的應(yīng)用前景

本研究中的多室水凝膠纖維最重要的優(yōu)點(diǎn)之一是與現(xiàn)有的基于纖維的生物制造方法相容，可用于構(gòu)建具有生理尺寸的更大結(jié)構(gòu)。圖6表明了纖維具有（1）打印多層網(wǎng)狀、單向結(jié)構(gòu)；（2）各類編織結(jié)構(gòu)；（3）細(xì)胞負(fù)載的編織與繩結(jié)結(jié)構(gòu)的能力。

圖6 多室水凝膠纖維在生物制造中的應(yīng)用

總結(jié)，本文利用靜態(tài)混合器與同軸打印相結(jié)合，制造多室水凝膠纖維的具有沿纖維軸向的內(nèi)部微絲，為改進(jìn)對(duì)天然肌肉組織的模擬和誘導(dǎo)成肌細(xì)胞對(duì)齊提供了機(jī)會(huì)。該生物制造策略簡(jiǎn)單而穩(wěn)健，且可以很容易地與任何擠壓生物打印或纖維紡絲裝置集成，以制造能夠控制細(xì)胞排列的多室支架。