超短激光脈沖實現(xiàn)選擇性單細胞生物打印

來源：EngineeringForLife

組織工程需要將哺乳動物細胞和生物材料精確打印在目標基底表面或者經(jīng)預處理的支架上。近年來，已有幾種技術可以實現(xiàn)該目標。其中基于噴墨和滴注的方法能以單細胞精度將活細胞進行打印，但其準確性不高且會對細胞造成損傷。另一類基于聲學的細胞圖案化技術可以同時對大量細胞進行高空間分辨率的打印，并保證細胞活性，但做不到選擇性地操作單個細胞。目前缺少能夠識別并選擇單個哺乳動物細胞并在保證生存率的條件下對其進行快速準確打印的技術。

近期，慕尼黑應用科技大學激光中心的Heinz P. Huber教授團隊在Advanced Functional Materials上發(fā)表了題為Single Cell Bioprinting with Ultrashort Laser Pulses的文章。該團隊開發(fā)了一種基于超短近紅外（NIR）激光脈沖技術的生物打印方法。該方法可以根據(jù)細胞形態(tài)或熒光從混合細胞群中選擇單個細胞，并以單細胞精度和高存活率將其打印到2D目標基底或預處理過的3D支架上。

圖1 打印設備原理和細胞打印演示

該團隊首先集成了利用激光實現(xiàn)細胞打印的LIFT技術和倒置光學顯微鏡，從而實現(xiàn)能在水平方向上觀察細胞，并以細胞形態(tài)差異或熒光從細胞群中對單個細胞進行選擇（圖1a）。其中激光波長為1030nm，該波長幾乎不會被細胞或其他生物材料吸收，但聚焦在水溶液中可以導致光學擊穿，從而形成一個迅速膨脹的氣泡，并產(chǎn)生水凝膠射流。將該激光以3uJ、600fs的脈沖聚焦在細胞下方約70μm深度時，可以將半徑約25μm范圍內(nèi)的一個或若干細胞從水凝膠中的細胞群中射出并打印到基底上（圖1c）。

圖2 a）熒光標記細胞、無標記細胞和無細胞狀態(tài)的打印過程；bcd）激光聚焦有橫向偏移的打印過程

然后，該團隊又將倒置顯微鏡換成了直立式，并在豎直平面方向上增設了一臺光學顯微鏡，用于觀察載單個細胞的水凝膠液滴的打印過程（圖1b）。圖2a是激光脈沖聚焦于52μm深度，在細胞被熒光標記、細胞沒有被熒光標記和無細胞的條件下分別拍攝的熒光圖像，整個射流過程沒有抖動，可以表明該方法具有很高的重現(xiàn)性和魯棒性。圖2b和2c分別是聚焦脈沖具有0μm、25μm和50μm的橫向偏移時從水平和豎直平面上觀察到的人腱干/祖細胞（hTSPC）射流的過程。在x=0μm時細胞位于水凝膠射流的尖端，x=25μm時細胞位于水凝膠射流80%的高度處，x=50μm時細胞位于更粗且速度更慢的第二射流中，當聚焦深度更深時，第二射流會不具備足夠能力將細胞送到目標基底上。

圖3 a）打印精度測試；b）單hMSC打印過程；cd）熒光標記分類打��；ef）3D結(jié)構打印

為了研究打印精度，該團隊分別以50、100和200μm的間隔打印了一行人類間充質(zhì)干細胞（hMSC），可見大多數(shù)細胞的偏移量小于一個細胞直徑（約為14～32μm）（圖3a）。為了研究打印后的細胞生存率，該團隊將hTSPC打印在涂有膠原蛋白的基底上，66小時后觀察到所有細胞仍有遷移行為，該試驗細胞存活率100%。在15組打印人乳頭狀甲狀腺癌細胞（TPC1）的實驗中得到了98.5±0.4%的存活率，在13組打印B16F1細胞的實驗中得到了96.5±0.7%的存活率，于其他采用LIFT技術的文獻數(shù)據(jù)相當。圖3b是依次將五個hMSC打印在交聯(lián)牛血清白蛋白（BSA）支架的過程。圖3c和d展示的是將GFP標記的hMSC和橙色熒光標記的TPC1從混合細胞群中分類打印到基底上。

為了證明該設備可以擴展到打印3D結(jié)構，該團隊用水凝膠Pluronic F-127向目標基底打印了五層600μm×120μm的線（圖3e和f）。其中水凝膠Pluronic F-127被稀釋到了15wt%，并在4℃下進行打印。打印到基底上后，水凝膠恢復室溫（22℃），粘度改變并最終形成穩(wěn)定的結(jié)構。

綜上所述，超短激光脈沖打印方法可以從混合細胞群中選擇單個哺乳動物細胞，以單細胞精度和93%-99%的存活率將其打印到目標基底或經(jīng)預處理的支架上。該技術目前限于人工搜索和選擇細胞，打印單次耗時約20s（細胞轉(zhuǎn)移時間小于100μs），結(jié)合自動化圖像分析和細胞識別軟件后可以實現(xiàn)自動化打印，大大提高可用性。由于該方法能夠快速、準確、高存活率地打印細胞，可以應用于制造細胞芯片、器官芯片、三維類器官等。

論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202100066