Biomaterials：投影式光固化3D打印仿生皮膚

來源： EngineeringForLife

由于日益增長的老齡化人口不斷推動需求的增長，在當(dāng)今臨床實(shí)踐中，容易移植的供體組織和器官的短缺仍然是一個重大問題。組織工程(通常由支架、細(xì)胞和生長因子組成)已成為修復(fù)受損組織的一種有前途的替代方法。對于現(xiàn)有的生物打印技術(shù)來說，制作適合植入的器官仍然是一個挑戰(zhàn)，主要原因是無法再現(xiàn)器官復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和生物功能。此外，無法制造具有營養(yǎng)輸送功能的微通道結(jié)構(gòu)，也限制了3D打印技術(shù)的臨床應(yīng)用。

作為人體最大、增長最快的器官，皮膚在保護(hù)身體免受外部損傷方面起著至關(guān)重要的作用。由于自我修復(fù)能力有限，三度燒傷和真皮全層缺損等創(chuàng)傷性傷口是最難愈合的傷口;因此，需要供體皮膚或生物工程人類皮膚構(gòu)建體(HSCs)來輔助再生過程。然而，由于供體皮膚的缺乏、長期生存能力差以及缺少造血干細(xì)胞的附屬物來，皮膚再生仍然是一個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。為此浙江大學(xué)的章淑芳副教授和歐陽宏偉教授課題組利用光固化3D打印技術(shù)，使用新設(shè)計(jì)的GelMA/ HA-NB/LAP生物墨水，打印了具有仿生結(jié)構(gòu)的仿生皮膚。仿生皮膚中相互貫通的孔道可以促進(jìn)營養(yǎng)物進(jìn)入和氧氣的交換，有利于細(xì)胞黏附，遷移和增殖與新生組織形成，相應(yīng)研究成果發(fā)表于期刊Biomaterials上。

研究人員采用GelMA/HA-NB/LAP作為材料，一方面原因在于其快速凝膠化特性，并且與天然ECM的結(jié)構(gòu)相似，這可以為細(xì)胞的生長和組織再生提供有益的微環(huán)境。同時(shí)，在紫外光的作用下，凝膠鏈上的醛基與胺基發(fā)生反應(yīng)，HA-NB可以很容易地調(diào)節(jié)凝膠的力學(xué)性能，如Figure1。此外，GelMA/HA-NB/LAP水凝膠還可作為一種粘合劑，在體內(nèi)植入時(shí)起到固定作用。在打印方法上，相較其他生物3D打印方法，基于投影式光固化的3D打印技術(shù)具有更高的打印速度、微尺度分辨率和更高的細(xì)胞存活率，在打印復(fù)雜器官結(jié)構(gòu)方面取得了突破。

圖1 快速光固化生物墨水與投影式光固化打印

皮膚通常分為兩層：致密的上層(表皮)和疏松的下層(真皮層)。為此研究人員設(shè)計(jì)了相應(yīng)的仿生結(jié)構(gòu)，上層(500μm)致密，有利于保護(hù)傷口免受外部機(jī)械沖擊和壓力。底層(1.5 mm)為懸臂梁多孔結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)細(xì)胞遷移和氧/營養(yǎng)交換，從而促進(jìn)血管生成，如Figure2。為確定最佳的孔徑尺寸，研究人員設(shè)計(jì)并打印了不同的微通道尺寸(200μm、300μm、400μm)。在經(jīng)過力學(xué)測試后，最終選擇了微通道尺寸為200μm的支架進(jìn)行進(jìn)一步的研究以修復(fù)皮膚缺損，而無微通道的支架作為對照。

圖2 3D打印復(fù)雜的雙層凝膠仿生皮膚結(jié)構(gòu)

為了評估基于投影式光固化的3D打印功能性皮膚的生物相容性，將HSFs和HUVECs分別混合入生物墨水并打印成無微通道和有微通道的支架。這些結(jié)果表明細(xì)胞存活率高(>95%)，支持細(xì)胞生長和增殖，水凝膠生物墨水具有良好的生物相容性，在構(gòu)建三維組織方面具有廣闊的前景，如Figure3（A-F）。然后，研究人員使用TIANamp基因組DNA試劑盒檢測結(jié)構(gòu)中不同層中HSFs和HUVECs的總DNA。第5天HUVECs的DNA含量幾乎比第1天高出2倍，HSFs在第5天的DNA含量比第1天高出近3倍，說明生物墨水支持HUVECs和HSFs的生長和增殖。功能化的活體器官需要維持其固有的結(jié)構(gòu)，以支持細(xì)胞的生長和增殖。在第5天的熒光通道下觀察到較低層的結(jié)構(gòu)被很好地區(qū)分出來，這表明整個結(jié)構(gòu)沒有失去其原有的設(shè)計(jì)，如Figure3G。

圖3 仿生皮膚的細(xì)胞相容性、細(xì)胞增殖和結(jié)構(gòu)可持續(xù)性

為觀察仿生皮膚內(nèi)的細(xì)胞遷移，研究人員將標(biāo)記的HSFs與HUVECs混于生物墨水中，并進(jìn)行分區(qū)域打印，如Figure4。標(biāo)記的細(xì)胞從最初的界限分明到5天后的互相滲透，結(jié)果證明相互連通的微通道結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)氧/營養(yǎng)灌注和誘導(dǎo)組織形成，從而促進(jìn)細(xì)胞吸附和遷移。

圖4 仿生皮膚內(nèi)的內(nèi)細(xì)胞遷移分析

此外，支架還必須支持宿主細(xì)胞的粘附、遷移和增殖，以刺激新組織的形成。為了評估這一特性，將HSFs和HUVECs作為宿主細(xì)胞接種在支架表面(無微通道)和仿生皮膚（含微通道）上，如Figure5。結(jié)果表明，該生物墨水具有良好的生物相容性，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，有可能在體內(nèi)吸引其他宿主細(xì)胞，促進(jìn)新組織的形成。

圖5 仿生皮膚外細(xì)胞遷移和粘附分析

研究人員使用大鼠和豬進(jìn)行了全層皮膚缺損模型實(shí)驗(yàn)，用以評估仿生皮膚的體內(nèi)治療效果。手術(shù)過程示意圖如Figure6所示，在背部表面創(chuàng)建一個缺損，然后將3D打印的仿生皮膚植入缺損處。為了將仿生皮膚牢固固定在缺損處，在所有縫隙處注入GelMA/HA-NB/LAP水凝膠，通過UV光交聯(lián)的GelMA/HA-NB/LAP水凝膠也可作為生物膠。對照組大鼠出現(xiàn)抓撓行為，而仿生皮膚植入組和正常組大鼠未出現(xiàn)防御反應(yīng)(無抓撓反應(yīng))。因此，這些結(jié)果表明，植入的仿生皮膚，成功地在機(jī)體表面起到了類似于自然皮膚的保護(hù)屏障作用。并且在炎癥反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，仿生皮膚與其他組相比，幾乎沒有或幾乎沒有炎癥跡象。表明仿生皮膚在不激活先天炎癥反應(yīng)的情況下，能夠提供理想的傷口愈合環(huán)境。在血管化實(shí)驗(yàn)中，它也能夠加速傷口愈合過程中的新血管形成，并促進(jìn)皮膚附件的真皮再生。

圖6 仿生皮膚用于大鼠全層皮膚缺損修復(fù)

而臨床相關(guān)大型動物模型的實(shí)驗(yàn)中表明，與對照組相比，仿生皮膚組的傷口愈合速度明顯更快，如Figure7。H&E染色還顯示，僅在仿生皮膚組有皮脂腺和毛囊形成，而對照組幾乎沒有形成皮脂腺和毛囊。此外，仿生皮膚組的再生皮膚結(jié)構(gòu)與天然皮膚的健康結(jié)構(gòu)非常相似(包括毛囊，血管，皮脂腺)。從TEM圖像可以看出，與正常組相似，與對照組相比，仿生皮膚組的膠原纖維排列整齊緊密。

圖7 仿生皮膚用于豬全層皮膚缺損修復(fù)

本研究表明，利用基于投影式光固化的3D打印技術(shù)結(jié)合仿生生物墨水和功能細(xì)胞制作仿生皮膚具有良好的可行性。仿生皮膚中相互連接的微通道有利于充分的營養(yǎng)交換，在促進(jìn)細(xì)胞和新形成組織之間的相互作用中發(fā)揮了重要作用。且仿生水凝膠生物墨水所提供的微環(huán)境能最大限度地促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖。體內(nèi)研究表明，無論在小型動物還是大型動物中，仿生皮膚都能促進(jìn)皮膚的傷口愈合，在皮膚附屬物(如毛囊)的再生方面也表現(xiàn)出了優(yōu)越的性能。

總之，基于投影式光固化的3D打印、仿生水凝膠生物墨水和功能細(xì)胞的獨(dú)特結(jié)合，為快速、大量生產(chǎn)生物活性器官提供了有效途徑，可以創(chuàng)造出更多的定制化和功能化的活體器官，并應(yīng)用于組織工程研究。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120287