我國科學(xué)家報道全球首個3D打印原代肝細(xì)胞癌個體化藥篩模型

來源：上普生物

肝癌是世界上最致命的腫瘤之一，肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是最常見的肝癌，占該疾病的90％。目前，經(jīng)驗性全身治療是晚期HCC患者的首選治療方法。然而，各種全身性藥物對晚期HCC患者的療效差異很大。侖伐替尼在所有一線或二線全身治療中均表現(xiàn)出最佳的客觀緩解率（ORR），但也只有24％，可見經(jīng)驗性靶向治療的效率較低。

針對這一問題，我們需要穩(wěn)定的針對特定患者的個性化體外癌癥模型。目前常用的臨床前模型是PDX模型，但PDX模型建立成本高，成瘤率底，時間慢，所以這么長時間都沒有落地在臨床應(yīng)用；另一種模型是類器官模型（Organoid），目前仍然是最高光的研究成果，但是均勻尺寸和細(xì)胞數(shù)量的類器官形成過程不可控，且此方法依賴病人原代HCC細(xì)胞的固有增殖能力（Ki67），總體成功率不高，無法常規(guī)構(gòu)建個性化類器官模型。

生物3D打印的出現(xiàn)和技術(shù)上快速的發(fā)展已經(jīng)可以有效地解決這些問題，北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科毛一雷教授課題組之前已經(jīng)在GUT上發(fā)表成功打印具有功能的肝臟類器官（Hepatorganoid），并具有人肝的藥物代謝功能，還在一個肝衰的動物模型上顯著延長了動物生存時間；課題組還在這個技術(shù)平臺上成功構(gòu)建了用于個性化藥物篩選的肝內(nèi)膽管癌腫瘤模型（Biofabrication發(fā)表）；而本次在以往的技術(shù)基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建出穩(wěn)定的、高效的人肝癌細(xì)胞的體外模型，并成功進行了多種藥篩。

近日，北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科毛一雷教授、楊華瑜副研究員和上�？萍即髮W(xué)的黃鵬羽教授團隊合作在Biomaterials雜志上發(fā)表文章Three-dimensional Bio-printing of Primary Human Hepatocellular Carcinoma for Personalized Medicine，使用生物3D打印設(shè)備，首次成功構(gòu)建了肝細(xì)胞癌個性化模型，并對4種常用的肝癌靶向藥物進行體外個體化篩選，取得了令人意想不到的結(jié)果。

3D打印個性化病人原代HCC模型

研究首次采用患者手術(shù)切除的HCC腫瘤樣本用于模型構(gòu)建，研究者將患者原代HCC腫瘤細(xì)胞與明膠海藻酸鈉生物墨水混合使用3D打印機打印成型。為了構(gòu)建個性化模型，研究者提取了6名不同患者的HCC樣本來構(gòu)建體外模型，并進行后續(xù)實驗。

3D打印構(gòu)建體外模型簡單高效，HCC細(xì)胞消化分離后2小時即可完成構(gòu)建。相比之下，類器官和PDX模型的形成需要幾個禮拜。并且，由于親本腫瘤增殖能力有限，類器官產(chǎn)生成功率僅有26％，有時甚至更低（20%以下），且形狀、細(xì)胞數(shù)量、密度均不可控。

3D打印個性化病人原代HCC模型的技術(shù)路線

3D打印HCC模型穩(wěn)定可靠
通過對3D打印HCC模型進行特異性生物標(biāo)志物（AFP）表達(dá)的測試，研究者發(fā)現(xiàn)，全部六名患者的個性化模型，AFP表達(dá)測試的結(jié)果與患者表達(dá)一致。這說明3D打印HCC模型可以保留HCC細(xì)胞的特定生物標(biāo)記。通過進一步進行外顯子組測序（WES），研究發(fā)現(xiàn)3D打印HCC模型與親本HCC組織的單核苷酸位點變異（SNV）保持高度一致性，并發(fā)現(xiàn)長期培養(yǎng)的模型很好的保留親本HCC組織的突變譜，尤其是HCC的關(guān)鍵突變。這說明3D打印HCC模型高度還原人類HCC的遺傳變異與表達(dá)譜，模型質(zhì)量十分可靠。

3D打印HCC模型親本肝癌特征檢測

3DP-HCC模型保留了原始腫瘤的遺傳改變和表達(dá)特征

為了了解長期培養(yǎng)的3DP-HCC模型中的細(xì)胞是否在體內(nèi)保留了原始HCC的致瘤潛力和組織學(xué)特征，研究者將3D打印HCC模型培養(yǎng)三周后分離出細(xì)胞，移植到小鼠皮膚下，并在小鼠受體中發(fā)現(xiàn)移植瘤。通過一系列實驗，研究者發(fā)現(xiàn)，原始HCC組織的典型細(xì)胞團結(jié)構(gòu)在移植瘤中得到了很好的保留。并且，通過測定生物標(biāo)志物（AFP與Ki67），研究者發(fā)現(xiàn)移植瘤和父母HCC標(biāo)本中均表達(dá)少量Ki-67，而PDX組織中AFP的表達(dá)明顯高于原始HCC標(biāo)本，這在患者的正常肝組織中未發(fā)現(xiàn)，因此，3D打印HCC模型可以保留其致癌潛力和組織學(xué)特征。

3D打印HCC模型異體移植

個性化腫瘤藥物篩選
3D打印病人原代HCC模型最具吸引力的應(yīng)用就是腫瘤藥物的個性化篩選。為驗證這一功能，研究者在這6名患者的模型中測試了4種常用的經(jīng)驗性靶向藥物（索拉非尼、侖伐替尼、瑞戈非尼、阿帕替尼）。

通過測定細(xì)胞存活率，研究發(fā)現(xiàn)，不同患者模型對于4種靶向藥物的反應(yīng)又不甚相同。例如，2號與5號患者模型對于4種藥物均產(chǎn)生抗藥性；對于1號患者，索拉非尼展示出更好的抗腫瘤作用，而對于3號患者，則是侖伐替尼抗腫瘤效果更好。進一步通過基因突變譜與藥物靶標(biāo)的對比測試，研究發(fā)現(xiàn)，藥物敏感性與突變靶標(biāo)具有良好的一致性。

同時，全外顯子測序（WES）顯示了6例患者的相應(yīng)突變譜�？傮w而言，藥物敏感性和突變靶標(biāo)之間的良好一致性清晰可見。攜帶PDGFR和VEGFR家族突變的患者＃1，＃3，＃4和＃6對索拉非尼或lenvatinib或兩者均敏感。但是，在患者＃2和＃5中沒有藥物敏感性和突變之間的這種相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)這兩名患者具有與其他患者相似的突變模式，但藥物敏感性差異很大，并且對所有四種藥物均具有耐藥性。造成這種差異的原因仍不清楚，但是對5號患者的轉(zhuǎn)錄組分析表明Raf-1，VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)實際上被下調(diào)，這可能是實現(xiàn)此耐藥機制的重要線索。

使用患者衍生的3DP-HCC模型評估六種HCC患者的多種經(jīng)驗靶向藥物的療效

為了實現(xiàn)針對患者的癌癥特異性治療，研究者們不斷進行認(rèn)真的努力，以建立可以代表人類腫瘤的各種體外模型。當(dāng)前，可以通過不同方法建立四種類型的患者源性HCC模型，包括傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)系統(tǒng)，類器官的3D培養(yǎng)系統(tǒng)，3D微流體培養(yǎng)和患者源性異種移植動物模型。其中生物3D打印的腫瘤模型優(yōu)勢顯著。

現(xiàn)有病人來源肝癌模型對比

本研究主要突破有：

1. 全球首次使用原代肝細(xì)胞癌細(xì)胞進行體外3D打印，并構(gòu)建出多個個體化模型，用于不同肝癌靶向藥物的個性化藥物篩選。

2. 3D打印原代肝細(xì)胞癌模型相比PDX和Organoid模型，構(gòu)建時間大幅縮短（數(shù)小時vs. 2-3個月）；形狀和密度非常均勻并可調(diào)控；保留了肝癌的親本性；構(gòu)建方法可靠性和穩(wěn)定性很高，且不依賴與原代腫瘤的固有增殖能力，具有極大的優(yōu)勢和潛力。并且成功進行了有意義的藥敏試驗。

3. 3D打印個性化肝癌藥篩模型的成功建立，提示了這種技術(shù)實際上可以不困難地拓展到人體的多種腫瘤，而不局限在肝癌。

4. 以后有希望將該技術(shù)用于多種腫瘤的個性化藥物篩選，在未來大規(guī)模藥物檢測和腫瘤病人個性化藥篩方面可能會有巨大的商業(yè)化應(yīng)用價值。

據(jù)悉，本文第一作者是來自北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科解飛虎博士，目前在中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院肝膽外科工作。通訊作者是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科的毛一雷教授、楊華瑜副研究員、和上�？萍即髮W(xué)的黃鵬羽教授。

原文鏈接

https://www.sciencedirect.com/sc ... i/S0142961220306621