印度理工學院：使用無交聯(lián)劑的絲素-明膠生物墨水進行軟骨組織工程的3D生物打印

供稿人:韓康，賀健康

軟骨是人體內高度分化的結締組織，由于缺乏血管、淋巴系統(tǒng)和較低的細胞密度，致使其自我再生能力有限。因此，對該組織的任何損傷都會在人體內保留多年，使軟骨進一步退化并最終引發(fā)關節(jié)功能受損，生活質量下降的退化性疾�。ㄈ绻顷P節(jié)炎）。

目前的治療策略包括微骨折、嵌合成形術、骨軟骨移植和自體軟骨移植(ACI)。這些方法在很大程度上改善了缺損修復的效果，但往往會導致低性能軟骨的形成，這只是延緩了組織退化的發(fā)生，延緩了骨關節(jié)炎的發(fā)生，并不是長期的臨床解決方案。因此，迫切需要潛在的替代治療方法。

近日，印度理工學院的研究者們開發(fā)了用于軟骨再生不含交聯(lián)劑的基于絲素-明膠生物墨水配方，該墨水由兩種不同的絲素（桑蠶和蓖麻）以及明膠混合而成，當兩種類型的絲素混合時，絲聚合物開始自凝膠化，明膠被纏結在這種凝膠絲基質上，形成了一種粘彈性墨水，是生物3D打印的最佳選擇。此外，將豬原代軟骨細胞封裝在墨水中以制成生物墨水，并對其可打印性，打印保真度，生物學以及功能評估進行研究（圖1）。

圖1 （A）生物墨水配方，（B）生物聚合物的纏結和相互作用，（C）數(shù)字建模和（D）充滿細胞的構建體的3D生物打印和成熟

研究者首先通過打印網(wǎng)格狀結構和形如人耳的解剖結構證明了該墨水的高保真度，良好打印性以及尺寸穩(wěn)定性。根據(jù)總體形態(tài)分析，構建體保留了其結構完整性（圖2A-B）。打印的網(wǎng)格結構的尺寸為7.25×7.25×3mm 3，絲間間距為0.75mm，層間增量為0.25mm。在打印類似于人耳的解剖結構的情況下，盡管為較大的尺寸（33×20×12mm3），但在打印過程中，打印的構造物是穩(wěn)定的，不會丟失其形狀或塌陷。墨水的高保真度和合適的粘度表明其能夠打印較大的解剖結構。

圖2 墨水的打印保真度（A）網(wǎng)格狀結構的打印（i）通過噴嘴擠出墨水，（ii）最初的幾層，（iii）形成網(wǎng)格狀圖案； （B）人體解剖耳朵的制造（i）CAD模型和生成的STL文件，（ii）使用切片器生成的G代碼，（iii）打印過程，以及（iv）打印的耳朵結構。

為表明開發(fā)的生物墨水配方具有細胞相容性，研究者使用鈣黃綠素-AM染色評估了生物打印構建物中封裝的軟骨細胞的活力。圖3A顯示了在第1天和第14天的軟骨細胞存活情況，該構建體表明軟骨細胞具有典型球形形態(tài)的均勻分布以及良好的活性。作為鈣黃綠素-AM染色的補充，圖3B顯示了在DAPI染色的冰凍切片中細胞的存在，且細胞均勻分布并排列成網(wǎng)格狀結構。此外，H＆E染色顯示整個構建體中細胞的附著和均一存在。

圖3 免疫熒光染色 （A）鈣黃綠素AM染色圖像; （B）DAPI標記的亮藍色細胞，和（C）構建體的H&E染色切片組織工程支架

總而言之，絲素-明膠聚合物共混生物墨水在軟骨組織工程中的潛在應用顯示出很高的可行性，并且可以根據(jù)需要進行結構，機械和生物相容性的定制化生物打印。

參考文獻：
Singh, Y. P.; Bandyopadhyay, A.; Mandal, B. B., 3D Bioprinting Using Cross-Linker-Free Silk-Gelatin Bioink for Cartilage Tissue Engineering. ACS Appl Mater Interfaces 2019, 11 (37), 33684-33696.

供稿人:韓康，賀健康 供稿單位：機械制造系統(tǒng)工程國家重點實驗室