徐銘恩主任：3D打印肝組織單元在藥物篩選中的作用

在第一屆Regenovo生物3D打印學(xué)術(shù)論壇上，浙江省醫(yī)學(xué)信息與生物三維打印重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任徐銘恩教授做了題為“3D打印肝組織單元在藥物篩選中的作用”的演講。在演講中，徐教授介紹了他們?cè)诖蛴「谓M織單元中遇到的一些問(wèn)題和在藥物篩選研究中所做的工作。

浙江省醫(yī)學(xué)信息與生物三維打印重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任

徐銘恩教授

肝臟是人體藥物代謝的主要器官，通過(guò)研究藥物在肝臟中的代謝機(jī)制，可以幫助我們篩選針對(duì)某些疾病的藥物。而通過(guò)3D生物打印技術(shù)打印出的肝組織，可以代替實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或器官，應(yīng)用于我們的藥物篩選中。

肝組織單元與3D打印

肝臟是由大概50-100萬(wàn)的肝小葉結(jié)構(gòu)組成的。因此，我們的設(shè)想是，如果能夠在體外把肝小葉結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)好打印出來(lái)，并且使它具有功能，就能夠像集成電路一樣把它們集成起來(lái)，最后變成一個(gè)肝臟。因此，我們的關(guān)注點(diǎn)是在怎樣構(gòu)建肝小葉的層次上的。

肝小葉有很多特殊的結(jié)構(gòu)，如中央靜脈、肝板、肝血竇等。除了細(xì)胞本身的表型以外，這些結(jié)構(gòu)對(duì)于最后功能的實(shí)現(xiàn)也會(huì)有影響，這也是3D打印的特長(zhǎng)所在，因此我們通過(guò)增加表面積、增加內(nèi)部液體的湍流等，研究了這些結(jié)構(gòu)對(duì)肝臟的影響。

組織的打印與細(xì)胞的培養(yǎng)

首先我們打印了如正方形、三角形等不同結(jié)構(gòu)的組織，在這些組織中，細(xì)胞會(huì)不停地復(fù)制分裂，然后形成一個(gè)一個(gè)的微球。這個(gè)微球會(huì)進(jìn)一步發(fā)展，到第13天的時(shí)候，這些微球之間會(huì)發(fā)生連接并融合。長(zhǎng)到30天的時(shí)候，組織內(nèi)部會(huì)形成一些典型結(jié)構(gòu)，一個(gè)就是支架完全被打印進(jìn)去的肝臟細(xì)胞所替代，除了替代掉的之外，還有一些材料沒(méi)有降解掉的，在這部分材料中也有一些細(xì)胞團(tuán)的存在。因?yàn)閮?nèi)部出現(xiàn)了低氧的環(huán)境，所以組織里面自發(fā)地出現(xiàn)了非常多的類(lèi)似血管的通道，保證了內(nèi)部養(yǎng)分的供應(yīng)。

通過(guò)激光共聚焦的方式，我們可以觀察內(nèi)部細(xì)胞的存活情況。從13天的數(shù)據(jù)來(lái)看，存活率是比較高的，而之后存活率也一直保持了一個(gè)比較高的狀態(tài)。

打印過(guò)程中的質(zhì)量控制

在培養(yǎng)出了具有結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的組織以后，我們?cè)谘芯抗δ艿臅r(shí)候發(fā)現(xiàn)，功能的標(biāo)準(zhǔn)偏差非常大。這到底是因?yàn)榧?xì)胞功能、打印處理或者誘導(dǎo)的問(wèn)題，還是本身結(jié)構(gòu)的問(wèn)題呢？

結(jié)構(gòu)問(wèn)題是我們?cè)诩?xì)胞表型后需要考慮的，因?yàn)樗�凝膠是非常軟的一種材料，在打印過(guò)程中，就有較大的形變。我們建立了一套復(fù)合合多種成像技術(shù)和處理算法的系統(tǒng)，對(duì)打印結(jié)構(gòu)進(jìn)行一個(gè)深度檢測(cè)和分析。在整個(gè)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，其實(shí)打印過(guò)程已經(jīng)出現(xiàn)了非常多的問(wèn)題，比如材料形變以及交聯(lián)過(guò)程中控制的不準(zhǔn)確等。

在此基礎(chǔ)上，我們建立了一系列的算法，對(duì)材料的孔徑、連通率、表面積等因素做了定量化的分析。利用這些算法我們可以做一個(gè)質(zhì)控，使得打印的結(jié)構(gòu)更為精準(zhǔn)地符合我們的設(shè)計(jì)。雖然生物本來(lái)就是非線性的，但是我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)于結(jié)構(gòu)的控制是線性相關(guān)的，這意味著我們可以對(duì)整個(gè)過(guò)程進(jìn)行精準(zhǔn)的反饋控制。相比之下，如果沒(méi)有基于這套量化分析的算法，不做控制打印出來(lái)的結(jié)構(gòu)的差異性是非常大的，而結(jié)構(gòu)的不同直接帶來(lái)了細(xì)胞生物活性的不一樣。

檢測(cè)細(xì)胞增殖

在排除掉結(jié)構(gòu)以及增殖過(guò)程對(duì)結(jié)構(gòu)的破壞因素之后，我們對(duì)細(xì)胞的增殖情況做了檢測(cè)。

細(xì)胞的增殖開(kāi)始有個(gè)快速的增長(zhǎng)過(guò)程，接著會(huì)進(jìn)入一個(gè)相對(duì)緩慢的增長(zhǎng)過(guò)程。大概在17-22天以后，細(xì)胞增殖進(jìn)入了一個(gè)相對(duì)平臺(tái)期，此時(shí)我們可以檢測(cè)它們的一些基本因素。比如白蛋白，而白蛋白的分泌在8周的時(shí)間里一直維持在一個(gè)比較平穩(wěn)的分泌水平。當(dāng)然，P450酶系、CYP3A4基因的表達(dá)等，也都是我們關(guān)注的點(diǎn)。

從整體上來(lái)看，跟平面培養(yǎng)的數(shù)據(jù)相比，3D打印之后的細(xì)胞內(nèi)一些P450酶系基因的表達(dá)不但沒(méi)有增加，反而開(kāi)始降低了，特別是到2-3天的時(shí)候達(dá)到一個(gè)低值。在排除掉打印過(guò)程中壓力和剪切力等導(dǎo)致了細(xì)胞表型發(fā)生變化等這些因素后，我們發(fā)現(xiàn)主要的原因應(yīng)該是長(zhǎng)時(shí)間平面培養(yǎng)的這些細(xì)胞在重新回到3D的環(huán)境下，本身就有一個(gè)適應(yīng)期。

藥物試驗(yàn)

過(guò)了66個(gè)小時(shí)之后，細(xì)胞增殖的數(shù)量就開(kāi)始上升，大概20天以后，我們用利福平這一典型的用來(lái)做肝損的陽(yáng)性藥物的實(shí)驗(yàn)。

我們?cè)O(shè)置了平面對(duì)照，發(fā)現(xiàn)差異非常大，不管這種差異是不是更接近于人體真實(shí)情況，差異的存在本身就意味著平面和3D之間存在區(qū)別，說(shuō)明這個(gè)研究是有價(jià)值的。

比如說(shuō)我們這里利福平它明顯地呈現(xiàn)對(duì)肝功能更為長(zhǎng)時(shí)間的影響。首先是三維條件下CYP3A4的表達(dá)相比平面的表達(dá)時(shí)間更長(zhǎng)。第二在利福平的作用下會(huì)有一些長(zhǎng)期的毒性顯示出來(lái)。

圍繞利福平，我們又做了一系列的數(shù)據(jù)，包括從CYP2B6，MRP2，BSEP等一系列跟肝臟藥物代謝相關(guān)的基因表達(dá)，跟平面之間都存在顯著差異。還有苯巴比妥、奧美拉唑等幾個(gè)典型的陽(yáng)性藥物，在這樣的模型中相比傳統(tǒng)的平面是有區(qū)別的。

在這個(gè)基礎(chǔ)上，我們嘗試開(kāi)發(fā)高通量篩選技術(shù)。高通量篩選需要基于在線即時(shí)檢測(cè)的技術(shù)。我們建立了包含多個(gè)叉指電極陣列的芯片，它依靠的是細(xì)胞跟電極之間接觸的阻抗來(lái)在線檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移和死亡情況。

打印之后有幾個(gè)問(wèn)題要解決。這種電極的設(shè)計(jì)是針對(duì)培養(yǎng)在平面的細(xì)胞，而現(xiàn)在細(xì)胞跟材料混在一起，我們需要確認(rèn)在這種情況下能否測(cè)到它的增殖和死亡情況。

我們做了一系列的測(cè)試，包括加不同的溶液，檢測(cè)頻率等條件，看它對(duì)細(xì)胞的信號(hào)的檢測(cè)有沒(méi)有影響。我們用傳統(tǒng)的Alamar bule實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞芯片的方式檢測(cè)過(guò)組織的增殖過(guò)程，在線性上是基本一致的。

腫瘤藥物篩選所希望的結(jié)果是，篩選出的藥物能夠最大程度殺死腫瘤細(xì)胞同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的損傷最小。我們把肝臟組織和和腫瘤組織打印在一塊芯片上，從陽(yáng)性藥物檢測(cè)來(lái)看，這個(gè)模型可以進(jìn)行精準(zhǔn)篩選。

同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，一些需要肝臟二次代謝物才有很強(qiáng)的抗腫瘤毒性的藥物，在這個(gè)模型中也能被篩選出來(lái)。

我們今后想做的一些工作是，比如通過(guò)集成將多種組織在一塊芯片上，然后加上肝臟看他們之間的反應(yīng)。

最后做一個(gè)總結(jié)，首先我覺(jué)得3D打印這個(gè)技術(shù)在個(gè)性化需求強(qiáng)烈的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于科學(xué)研究來(lái)說(shuō)它是一個(gè)很好的工具。特別是這個(gè)工具可以有可控結(jié)構(gòu)的材料以及可以把細(xì)胞打印成特殊的結(jié)構(gòu)。無(wú)論為組織工程也好，藥物的精準(zhǔn)化篩選、個(gè)性化給藥也好，都是提供了一種全新的可能,請(qǐng)關(guān)注南極熊3d打印網(wǎng)。


來(lái)源：火石創(chuàng)造
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