南極熊教你3D打印心臟：生物3D打印技術(shù)深入解讀之二

該文章的作者是南極熊網(wǎng)友：中國生物3d打印機開發(fā)者劉博士。劉博士將從組織工程、生物制造、幾種關鍵技術(shù)、生物3D打印輸送系統(tǒng)等部分介紹。由于文章內(nèi)容很充實，南極熊將以連載的形式給大家介紹。

生物3D打印關鍵技術(shù)

生物三維打印的目標就是根據(jù)生物學和組織工程產(chǎn)品的要求，采用計算機建模技術(shù)設計三維模型，將生物材料（支架材料）、細胞和生長因子等，使用某種使能方法，將材料離散為零維的點單元或一維線單元，然后按照模型信息，將這些離散的材料單元層層堆積裝配成為所設計的結(jié)構(gòu)。材料和CAD模型信息是輸入，針對所使用的材料及其性能，設計生物打印過程，根據(jù)打印過程需求，設計生物打印裝備，最終將產(chǎn)品打印出來（如支架、三維細胞結(jié)構(gòu)體甚至人工組織器官）。所謂生物打印過程設計包括材料的預制備過程、材料打印過程和打印后處理過程，材料預制備過程是指生物材料需配置成溶液、粉末或絲材等作為打印原料的過程；材料打印過程是指用何種成形轉(zhuǎn)變機制將離散的材料單元裝配成為完整的三維結(jié)構(gòu)，常見的方法包括加熱熔融后凝固成形、低溫凝固成形、交聯(lián)固化成形、光固化成形、粉末燒結(jié)成形和粘接劑粘接成形等，選擇合適的成形轉(zhuǎn)變機制是打印過程設計的關鍵一環(huán)；后處理過程是指對打印后的結(jié)構(gòu)進行后續(xù)的處理工藝設計，如低溫沉積工藝制造的支架需要通過冷凍干燥工藝去除有機溶劑，細胞三維受控組裝工藝制造的細胞三維結(jié)構(gòu)需要通過離子交聯(lián)或共價交聯(lián)進行結(jié)構(gòu)的固定以及合成聚合物支架為改善細胞黏附性能從而進行材料表面改性等。

因此，生物三維打印系統(tǒng)的設計不僅僅是裝備的設計，而是首先根據(jù)目標產(chǎn)品的要求，進行材料體系設計，選擇被打印的生物材料，根據(jù)材料的性能，設計可行的打印工藝，然后根據(jù)打印過程的要求再進行裝備的設計�？紤]到生物材料種類繁多，材料性能不一，設計一臺可適用于所有生物材料加工的三維打印裝備是非常困難的。

生物三維打印的研發(fā)過程及其關鍵技術(shù)

生物三維打印技術(shù)的研發(fā)過程如圖2.1所示，所有組織工程技術(shù)研發(fā)的起點應該是選定目標修復組織，然后分析組織器官的結(jié)構(gòu)特點，有些組織為二維層片狀，如皮膚、角膜、軟骨等；有些則為管狀類，如血管等；有些為三維塊狀，如骨組織以及肝臟、腎臟、心臟等復雜器官。根據(jù)被修復組織器官的結(jié)構(gòu)特點，確定其是否適合于用生物三維打印技術(shù)來構(gòu)建，該技術(shù)更加適合于具有三維塊狀結(jié)構(gòu)特征的組織，而二維層片狀組織如皮膚、角膜和軟骨等可能更加適合其它類技術(shù)。若選定生物三維打印技術(shù)后，則需考慮是基于支架技術(shù)路線還是無支架技術(shù)路線。一般來講，無支架技術(shù)路線目前受限于可以加工的材料種類，往往使用力學性能較差的天然生物材料和細胞，因此適用于軟組織的構(gòu)建；而支架則可以用合成聚合物材料制造，力學性能可以根據(jù)組織特點在很寬的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，不但適合軟組織也適合硬組織的構(gòu)建。

圖2.1 生物三維打印技術(shù)研發(fā)過程

對于基于支架的生物三維打印技術(shù)，選擇合適的細胞種類及來源，進行體外擴增。然后設計三維支架，支架的設計包括支架材料設計和支架結(jié)構(gòu)設計，根據(jù)所選用的生物材料及其性能，設計其使能方法，如熔融擠壓、低溫凝固、熔融粘接、粉末燒結(jié)或輻射固化等，根據(jù)所選擇的使能方法，開發(fā)生物三維打印設備，制造所設計的支架，然后種植細胞，進行體外培養(yǎng)，最終獲得人工組織或器官。

對于無支架生物三維打印，首先進行組織器官模型設計，包括細胞類型選擇及其來源，基質(zhì)材料設計和模型結(jié)構(gòu)設計；然后選擇裝配單元類型，一般可以采用連續(xù)線單元或離散點單元，不同的單元類型，則裝配使能方式的設計也不同；然后開發(fā)打印設備，進行組織器官模型打印，經(jīng)體外培養(yǎng)后獲得人工組織器官。在上述研發(fā)過程中，除細胞及其來源是生物學需解決的基礎問題外，涉及的關鍵技術(shù)包括：

（1）     材料體系設計——材料體系設計是生物三維打印的關鍵一環(huán)，單一類型的生物材料可能無法滿足組織修復的需求，材料設計應該從仿生的角度綜合考慮生物相容性、機械性能和材料降解性能等選擇合適的生物材料體系及組成，此外，材料體系的設計決定了材料使能方式。

（2）      支架和組織器官模型的建模技術(shù)——支架和組織器官模型的結(jié)構(gòu)設計包涵了宏觀外形、微觀結(jié)構(gòu)和材料分布，理想的情況是能夠模擬人體天然組織的特征，構(gòu)建非均質(zhì)模型。

（3）      材料使能技術(shù)——材料體系設計之后，選擇合適的使能方式將材料離散成為點單元或線單元來層層構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)，且實現(xiàn)材料單元之間的連接是實現(xiàn)結(jié)構(gòu)成形的關鍵一環(huán)，這些均取決于材料本身的性能。

（4）     生物三維打印設備開發(fā)——生物三維打印設備一般包括運動系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、軟件界面、材料輸送系統(tǒng)和成形環(huán)境設計等方面，是典型的機電一體化設備，屬于先進制造技術(shù)與生命科學的交叉前沿。

（5）       體外培養(yǎng)技術(shù)及后處理——打印后的細胞-支架復合體或組織器官模型必須經(jīng)過體外培養(yǎng)才能重建其生理功能，其中生物反應器的設計是關鍵，生物反應器為構(gòu)建的人工組織提供外源性的各種刺激來模擬人體生理環(huán)境，重要的因素包括O2和CO2濃度、細胞因子、溫度、力學信號、PH值以及灌流速率等。

   為使基于生物三維打印的人體修復技術(shù)走向臨床應用，必須解決上述關鍵技術(shù)中的每一個問題，并制定相應的設計標準，而目前仍處于研究階段，本論文關注的則是與制造相關的問題包括建模技術(shù)、材料使能技術(shù)和設備開發(fā)相關的問題，尤其關注解決材料使能技術(shù)和設備開發(fā)兩方面。   

生物三維打印材料及使能技術(shù)

生物材料可以分為三類，即支架材料、細胞以及生物活性分子，其中支架材料為細胞提供黏附表面，并作為細胞遷移、增殖和分化的外部環(huán)境，提供機械支撐。細胞作為生命的基本單元，可以看做一種特殊的材料，細胞與支架材料之間的相互作用對支架植入體內(nèi)后的變化起著關鍵作用，細胞可在支架制造完成后再進行體外種植，在這種情況下細胞不直接參與打印過程，此時的生物三維打印過程就僅僅是支架材料的三維打印。細胞也可直接作為被打印材料，參與制造過程，此時的生物三維打印就是細胞三維打印，細胞必須與某種具備成形轉(zhuǎn)變機制的外基質(zhì)材料同時打印以輔助結(jié)構(gòu)的成形（往往選用水凝膠材料）。生物活性分子包括一大類對細胞的生理功能起調(diào)節(jié)作用的分子，如生長因子、類固醇、激素、多肽甚至DNA和RNA，目前將這些分子作為單獨的打印材料參與制造過程仍然面臨很大的困難，因為這些分子在支架內(nèi)很難固定，體外培養(yǎng)時很容易擴散到培養(yǎng)介質(zhì)中，導致效果不佳，目前采用的解決方法為支架制造后進行材料表面改性或在將支架本身作為生長因子緩釋的載體以提高細胞的功能表達和組織形成能力。

生物材料使能技術(shù)是實現(xiàn)生物三維打印的關鍵一環(huán)，如何將生物材料離散然后堆積成為三維結(jié)構(gòu)是材料使能技術(shù)需要解決的問題。為了便于應用，表2.1列出了常見的生物材料使能方法、原材料形式、適用材料和優(yōu)缺點。

從表2.1中可以看出，應用于生物三維打印的材料使能技術(shù)多種多樣，材料體系的設計則是選擇材料使能方式的基礎，而材料體系的設計則取決于被修復組織器官的需求。

表2.1常用生物材料及其使能方式

材料	使能    方法	原料	適用材料	優(yōu)點	缺點
支架材料	FDM熔融粘接	絲材	熱塑性聚合物如PCL、PLA、PGA、PLGA；PLGA-TCP/HA復合材料	裝置簡單、可直接購置商用三維打印機	材料結(jié)構(gòu)被破壞，尤其是分子量發(fā)生改變、原材料制備復雜、復雜結(jié)構(gòu)需要支撐
	激光選擇燒結(jié)	粉末	激光下可熔融但不分解的粉末材料，如PCL、PCL/TCP、HA、PVA、PLA等	可加工的材料范圍較廣、復雜結(jié)構(gòu)無需支撐	設備復雜、材料在激光作用下可能會發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞
	光固化	光敏材料	可光聚合的大分子單體	精度高、制造效率高、復雜結(jié)構(gòu)無需支撐	需要專門的可光固化材料體系、殘留的未聚合單體和光引發(fā)劑有毒性
	粘接劑粘接	粉末	可制備成粉末且在某種粘接劑下粘結(jié)的材料如HA等	制造復雜結(jié)構(gòu)無需支撐	需選擇合適的生物相容性好的粘接劑
	溶劑低溫結(jié)晶	溶液	可溶于某種溶劑、在低溫下結(jié)晶的聚合物，如PLA、PGA、PLGA、PCL、明膠、海藻酸鈉、膠原等	材料適用范圍廣，可制造多級孔隙支架，加入TCP或HA粉末制造復合材料支架	需有機溶劑，殘留的有機溶劑有毒性，設備復雜，復雜結(jié)構(gòu)需支撐
水凝膠材料	溫度物理交聯(lián)	溶膠	在溫度變化下發(fā)生溶膠凝膠轉(zhuǎn)變的材料，如明膠、透明質(zhì)酸、卡拉膠等	無需交聯(lián)劑、可通過噴射過程溫度的變化來成形、過程無細胞毒性	溶膠凝膠轉(zhuǎn)變過程可逆、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)變過程較慢
	離子    交聯(lián)	溶膠	在離子作用下發(fā)生離子交聯(lián)的聚合物，如海藻酸鈉在二價陽離子作用下、殼聚糖在多聚磷酸鈉作用下	轉(zhuǎn)變過程較物理交聯(lián)迅速、形成的凝膠網(wǎng)絡較穩(wěn)定	過程不易控制，交聯(lián)劑導致堆積的材料連接強度較弱
	共價    交聯(lián)	溶膠	在某些物質(zhì)作用下發(fā)生共價交聯(lián)的聚合物，如纖維蛋白在凝血酶作用下，明膠、海藻酸鈉、殼聚糖、膠原、纖維蛋白等在戊二醛等作用下	轉(zhuǎn)變過程迅速、可形成最為穩(wěn)定的共價交聯(lián)凝膠網(wǎng)絡	過程不易控制，且含醛基的物質(zhì)具有一定的細胞毒性
	輻照共價交聯(lián)	溶膠	在光照射作用下發(fā)生共價交聯(lián)材料，如膠原在紫外光作用下	可形成穩(wěn)定的共價交聯(lián)凝膠網(wǎng)絡	輻照對細胞損傷大、不易用于三維打印

生命體計算機仿生建模技術(shù)

用于組織修復的支架或細胞結(jié)構(gòu)體的計算機建模技術(shù)是生物三維打印的重要組成部分，只有建立了計算機數(shù)字模型的基礎上，才能夠?qū)��?shù)字模型打印成為實體結(jié)構(gòu)。在傳統(tǒng)的三維打印中，被打印對象往往為均質(zhì)結(jié)構(gòu)，即材料和結(jié)構(gòu)在整個打印對象內(nèi)是均勻分布的。而人體器官的組成結(jié)構(gòu)則體現(xiàn)出極其復雜的非均質(zhì)特性，人體天然組織往往可以劃分為多個區(qū)域，如人體骨關節(jié)可以分為軟骨區(qū)域、鈣化層、軟骨下骨區(qū)域（松質(zhì)骨）等組成，圖2.2為股骨的區(qū)域劃分，這些區(qū)域的細胞類型、材料組成、力學性能和外形輪廓差異非常大。

圖2.2 股骨區(qū)域劃分示意

仿生設計則是根據(jù)天然組織不同區(qū)域的性能要求，合理地選擇材料、設計結(jié)構(gòu)和外形，并用計算機數(shù)字模型表達。仿生建模的第一步是對象的分解，整體結(jié)構(gòu)為各個子區(qū)域的并集。

而每個子區(qū)域Oi(i=1…n)的屬性包括材料、結(jié)構(gòu)和外形三個要素，即

其中材料的確定依賴于子區(qū)域的細胞黏附和生長要求、力學性能要求、生物相容性和生物降解性能等，因此：

結(jié)構(gòu)（architecture）則包括微觀結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)，包括孔隙的形狀、大小、相互貫通性和孔隙率等特性，結(jié)構(gòu)的確定取決于細胞和組織長入需求，氧、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等擴散需求，力學性能需求等，因此：

外形既包括整個結(jié)構(gòu)的宏觀外形，又包括各個子區(qū)域間的空間輪廓邊界。從仿生的角度考慮，兩部分外形均應按照人體天然組織來設計。目前，醫(yī)學影像技術(shù)的發(fā)展尤其是計算機斷層掃描技術(shù)（computedtomography，CT）和核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）為確定人體結(jié)構(gòu)的宏觀外形和組織邊界奠定了基礎。通過CT和MRI二維圖像結(jié)合mimics等模型重構(gòu)軟件可以逆向地獲得人體組織器官的三維模型。這為確定結(jié)構(gòu)的宏觀外形和各個子區(qū)域的空間輪廓邊界提供了有利條件。

在劃分子區(qū)域的基礎上，可以有兩種方法制造出包含多個子區(qū)域的整體結(jié)構(gòu)：即子區(qū)域分體制造+裝配的方式和整體制造。分體制造然后裝配的思路類似于機械設計中的零件與裝配體之間的關系，這種方式可以大大減小制造難度，然而子區(qū)域間的連接方法、連接的可靠性和區(qū)域邊界的吻合程度等問題使得分體制造然后裝配的路線面臨很大的困難�？赡芸紤]的方式是研發(fā)某種生物相容性好的粘接劑可以將生物結(jié)構(gòu)粘接在一起，目前尚未檢索到采用這種思路的相關研究。

對于整體制造，若采用生物三維打印技術(shù)，則需要多個噴頭按照各個子區(qū)域的要求打印相應的材料，然后堆積成為整體的三維結(jié)構(gòu)。

進一步分析，對材料而言，子區(qū)域內(nèi)的材料materials(oi)又可能存在如下如下兩種情況：

均質(zhì)材料——即子區(qū)域內(nèi)各處材料成分及組成是一致的，無論其復合多少種材料，都可看做一種材料，這樣就大大簡化了問題的復雜度，僅需一個噴頭就可以制造出一個子區(qū)域；

非均質(zhì)材料——即子區(qū)域內(nèi)部各處的材料及組成是變化的，在這種情況下問題的復雜度會大大增加，僅單個子區(qū)域的制造就需要多個噴頭才能實現(xiàn)。

事實上，當把組織器官按照結(jié)構(gòu)和功能劃分為多個子區(qū)域后，組織器官子區(qū)域內(nèi)的細胞種類和外基質(zhì)構(gòu)成基本是相同的，因此，無需在子區(qū)域內(nèi)采用非均質(zhì)材料來構(gòu)建。在這種情況下，對生物三維打印而言，所需的噴頭數(shù)量即等于所劃分的子區(qū)域數(shù)目。

可能存在的一種情況是在子區(qū)域間的界面上可能需要梯度材料結(jié)構(gòu)，這種具有材料成分漸變特征的梯度結(jié)構(gòu)的模型如圖2.3所示。構(gòu)建這類復雜的組織界面仍然是目前組織工程中面臨的巨大挑戰(zhàn)。

圖2.3 組織過渡界面上的材料組分漸變梯度結(jié)構(gòu)

目前現(xiàn)有的非均質(zhì)實體建模方法包括：全局函數(shù)合成、局部函數(shù)合成、材料區(qū)域指定、基于元胞單元體（unit cells）布爾運算建模以及由清華大學鄭衛(wèi)國提出的基于區(qū)域/模板填充建模技術(shù)。迄今為止，非均質(zhì)建模技術(shù)尚未包含到商業(yè)CAD軟件系統(tǒng)中，導致非均質(zhì)建模技術(shù)在應用時面臨很大的困難。此外，此類材料組分漸變的梯度界面對于構(gòu)建用于組織修復的支架或細胞三維結(jié)構(gòu)體的必要性和意義也有必要進一步探討。

對于結(jié)構(gòu)而言，前面已提及，其對細胞向支架內(nèi)部遷移、新生組織的生長、營養(yǎng)物質(zhì)交換和代謝產(chǎn)物排出以及支架的力學性能具有重要的影響。對于生物三維打印而言，宏觀孔隙是由材料路徑交叉交叉形成的，通過控制材料路徑的間距和交叉取向可以獲得不同的孔隙形狀、大小以及相互貫通性，如圖2.4所示。

圖2.4 由材料路徑形成的不同形狀和大小的孔隙結(jié)構(gòu)

劃分后的子區(qū)域需要根據(jù)生物學和力學性能要求選擇最優(yōu)的孔隙結(jié)構(gòu)，然而建立這些不同孔隙的結(jié)構(gòu)與生物學性能和力學性能之間的聯(lián)系并針對特定的應用進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面的工作仍然非常欠缺。

根據(jù)支架的復雜度等級、材料和結(jié)構(gòu)的梯度特征，論文將支架劃分為如下五類，如表2.2所示，根據(jù)分析，構(gòu)建多區(qū)域梯度支架具有重要的研究價值，在此基礎上根據(jù)組織器官構(gòu)建的需求，可以考慮包含材料組分梯度變化的子區(qū)域界面，而子區(qū)域內(nèi)的材料梯度和結(jié)構(gòu)梯度意義不大。

表2.2 不同復雜度等級的支架

支架復雜度	材料特征	結(jié)構(gòu)特征	難度	重要性
I級    均質(zhì)均結(jié)構(gòu)支架	均質(zhì)材料	無梯度變化結(jié)構(gòu)	★	無法滿足組織工程要求
II級    多區(qū)域梯度支架	1.子區(qū)域材料為均質(zhì)    2.各子區(qū)域材料不同	1.子區(qū)域無梯度結(jié)構(gòu)    2.各子區(qū)域的結(jié)構(gòu)不同	★★	重要
III級    多區(qū)域梯度支架    材料組分梯度界面	1.子區(qū)域材料為均質(zhì)    2.各子區(qū)域材料不同    3.子區(qū)域界面材料組分梯度變化	1.子區(qū)域無梯度結(jié)構(gòu)    2.各子區(qū)域結(jié)構(gòu)不同    3.子區(qū)域界面無結(jié)構(gòu)梯度	★★★	有待研究
IV級    多區(qū)域梯度支架    材料組分梯度界面    子區(qū)域結(jié)構(gòu)梯度	1.子區(qū)域材料為均質(zhì)    2.各子區(qū)域材料不同    3.子區(qū)域界面材料梯度變化	1.子區(qū)域為梯度結(jié)構(gòu)    2.各子區(qū)域結(jié)構(gòu)不同    3.子區(qū)域界面無結(jié)構(gòu)梯度	★★★★	子區(qū)域結(jié)構(gòu)梯度意義不大
V級    多區(qū)域梯度支架    材料組分梯度界面    子區(qū)域結(jié)構(gòu)梯度    子區(qū)域材料梯度	1.子區(qū)域材料為非均質(zhì)    2.各子區(qū)域材料不同    3.子區(qū)域界面界面材料梯度變化	1.子區(qū)域為梯度結(jié)構(gòu)    2.各子區(qū)域結(jié)構(gòu)不同    3.子區(qū)域界面無結(jié)構(gòu)梯度	★★★★★	子區(qū)域結(jié)構(gòu)梯度意義不大    子區(qū)域材料梯度意義不大

因此，目前重點研究的應為表中II級復雜度即多區(qū)域梯度支架的建模技術(shù)以及相應的制造方法。

以上談到的主要為生物材料支架，對于無支架技術(shù)路線，方法是類似的，區(qū)別在于不同區(qū)域內(nèi)的材料是指不同的細胞類型。

生物三維打印設備開發(fā)

生物三維打印設備是將計算機虛擬數(shù)字模型轉(zhuǎn)變?yōu)閷嵨锏暮诵募夹g(shù)裝備，也是生物三維打印技術(shù)研發(fā)的關鍵環(huán)節(jié)。這類設備包含一般三維的共性技術(shù)包括：

（1）三軸運動系統(tǒng)（three-axismotion system）——XYZ三軸運動系統(tǒng)是所有三維打印設備的必備部分，一般由XY軸進行平面掃描運動，Z軸帶動升降平臺實現(xiàn)材料的層層堆積制造。一般各軸的運動均是通過電機驅(qū)動的，根據(jù)電機類型，可以分為：步進電機運動系統(tǒng)、伺服電機運動系統(tǒng)和直線電機運動系統(tǒng)。運動系統(tǒng)的選擇直接關系到設備的定位精度和設備成本，其選擇應該在滿足使用要求的基礎上盡量降低成本。

（2）數(shù)控系統(tǒng)（motion controlsystem）——數(shù)控系統(tǒng)是驅(qū)動所有電機運動的核心控制部分，對生物三維打印設備而言，需要按照數(shù)控代碼實現(xiàn)多個運動軸的協(xié)調(diào)運動，因此需要高性能的多軸運動控制器作為核心來搭建數(shù)控系統(tǒng)，數(shù)控系統(tǒng)的性能對生物三維打印設備的最終性能也有重要的影響。

（3）材料輸送系統(tǒng)（materialsdelivery sytem）——材料輸送系統(tǒng)是生物三維打印系統(tǒng)的核心部分，其設計需根據(jù)所選用的生物材料性能，選擇相應的使能方式，然后根據(jù)使能方式確定輸送系統(tǒng)的設計。

（4）成形環(huán)境設計（formingenvironment design）——對于任意一種生物三維打印裝置，可能都需要工作在某種特定的溫度、濕度甚至清潔度等條件下，相應的成形環(huán)境的設計也是設備開發(fā)的重要方面。

（5）成形控制軟件界面（Graphic-User-Interfacesoftware）——控制軟件的功能是將計算機建立的數(shù)字模型進行信息的加工處理，轉(zhuǎn)換成為驅(qū)動電機運動的數(shù)控代碼，并監(jiān)控制造過程。

在以上子系統(tǒng)中，材料輸送系統(tǒng)是硬件系統(tǒng)中最為核心的部分，也是生物三維打印區(qū)別于普通三維打印的根本所在。本論文將以細胞-水凝膠材料連續(xù)線單元作為裝配單元來設計細胞三維打印設備。

生物3D打印技術(shù)深入解讀之一http://m.lhkhtyz.com/thread-43724-1-1.html
生物3D打印技術(shù)深入解讀之二http://m.lhkhtyz.com/thread-43797-1-1.html
生物3D打印技術(shù)深入解讀之三http://m.lhkhtyz.com/thread-43870-1-1.html

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