南極熊教你3D打印心臟：生物3D打印技術(shù)深入解讀之一

     該文章的作者是南極熊網(wǎng)友：中國生物3d打印機(jī)開發(fā)者劉博士。劉博士將從組織工程、生物制造、幾種關(guān)鍵技術(shù)、生物3D打印輸送系統(tǒng)等部分介紹。由于文章內(nèi)容很充實(shí)，南極熊將以連載的形式給大家介紹。今天先來看目前常見的各種生物制造技術(shù)。

從組織工程到生物制造及生物3D打印

     組織工程，又稱之為“再生醫(yī)學(xué)”，是一門用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理和方法，利用生物材料和生物活性物質(zhì)，體外培養(yǎng)或構(gòu)建用于修復(fù)或提高組織器官功能替代物的技術(shù)。從1987年美國國家科學(xué)基金委員會(huì)提出“組織工程”的概念至今，已歷經(jīng)二十余年的發(fā)展。目前多種組織工程產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用，尤其是厚度較小或無血供的組織，如皮膚、軟骨、血管等，但復(fù)雜組織器官的構(gòu)建和再造仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。

    傳統(tǒng)的組織工程三要素包括：種子細(xì)胞（cells）、支架（scaffold）和生長因子（growth factors）。最初的組織工程策略是將體外分離培養(yǎng)的種子細(xì)胞種植在合適的支架上，并在生長因子的環(huán)境下進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟后，將細(xì)胞-支架復(fù)合體植入到體內(nèi)，作為受損組織的替代物，以修復(fù)組織器官。

    根據(jù)最初的設(shè)想，當(dāng)細(xì)胞被置于支架材料時(shí)，細(xì)胞會(huì)在材料表面發(fā)生黏附、遷移、增殖和分化等行為，在特定信號(hào)因子作用下，發(fā)生細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用，且細(xì)胞會(huì)進(jìn)行正常的生理活動(dòng)，如分泌細(xì)胞外基質(zhì)、營養(yǎng)代謝等，而支架材料會(huì)逐漸被細(xì)胞所分泌的代謝產(chǎn)物降解，在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和細(xì)胞-支架材料相互作用的聯(lián)合效應(yīng)下，最終形成由細(xì)胞和細(xì)胞分泌的外基質(zhì)構(gòu)成的組織。

    最初，人們關(guān)注什么樣的材料才能作為細(xì)胞增殖的外部環(huán)境，這種材料必須具有良好的細(xì)胞相容性，并且能夠刺激細(xì)胞的正常生理功能，因此誕生了“生物材料”這門新興的材料學(xué)分支學(xué)科。第一代生物材料來源于工業(yè)化的材料，主要為生物惰性材料，如醫(yī)用鈦合金、不銹鋼等人工關(guān)節(jié)材料；二代生物材料典型特征為生物活性以及生物可降解材料，材料與人體組織能夠發(fā)生可控的反應(yīng)，并具有可控的降解性，如合成的聚合物材料以及天然生物材料等；三代生物材料則力求在分子水平上能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生特殊應(yīng)答反應(yīng)，如誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和組裝等。生物材料已經(jīng)取得了矚目的成就，然而作為組織工程用的生物材料仍然面臨很大限制。

    最理想的生物材料是人體細(xì)胞的天然外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)是一種成分和結(jié)構(gòu)都極其復(fù)雜的納米復(fù)合材料，包括10nm~幾百納米的膠原纖維、彈性纖維等結(jié)構(gòu)蛋白，層黏連蛋白、纖連蛋白等功能蛋白以及糖胺聚糖（GAGs）和蛋白聚糖（PG）等多糖類，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且在外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中分布著各種生長因子和信號(hào)分子以及特異性結(jié)合點(diǎn)位，這種誘導(dǎo)性的三維微環(huán)境（instructive 3Dmicro- environment）對細(xì)胞的生理功能起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。然而迄今為止，人類仍然無法仿生地制備具有和天然細(xì)胞外基質(zhì)相似成分和結(jié)構(gòu)的生物材料。目前用于組織工程的材料可以分為天然生物材料和合成生物材料[5]。天然生物材料主要為蛋白和多糖類，如膠原、明膠、海藻酸鹽、殼聚糖、幾丁質(zhì)等；合成生物材料主要為高分子材料，其中研究最多的是脂肪族聚酯類，如PLA、PGA和PLGA等。天然生物材料的優(yōu)點(diǎn)在于具有較好的生物相容性，但較難以實(shí)現(xiàn)材料的可控降解，材料性能一致性差，且機(jī)械性能較差；合成生物材料的優(yōu)點(diǎn)在于其具有可控的降解性和機(jī)械性能，材料性能一致性較好，但生物相容性較差。生物材料的局限也使得組織工程的研究受到了很大的限制。

除了成分，材料結(jié)構(gòu)對細(xì)胞功能的影響也不可忽略。組織工程支架是細(xì)胞生長的載體，最初人們對支架的性能要求包括：

Ø  相互貫通的孔隙，合理的孔隙結(jié)構(gòu)和尺寸，以便于細(xì)胞長入、營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝產(chǎn)物的排出，并為血管長入和血管化預(yù)留空間；

Ø  高孔隙率以提高細(xì)胞種植密度；

Ø  合適的機(jī)械性能以作為病損或受損組織的臨時(shí)替代

Ø  合適的降解速率以匹配新生組織的生長；

Ø  良好的生物相容性和支架表面化學(xué)性能，以有利于細(xì)胞的黏附、增殖和分化；

    因此，傳統(tǒng)的支架關(guān)注的是材料的宏觀性能（macroscopicfeatures）以及機(jī)械性能與被修復(fù)組織器官的匹配性，然而隨著研究的深入，仿生地構(gòu)建具有和天然細(xì)胞外基質(zhì)相似的納米復(fù)合結(jié)構(gòu)、重建細(xì)胞三維微環(huán)境對細(xì)胞的功能具有關(guān)鍵的影響。2005年發(fā)表于《Science》的文章指出，細(xì)胞在微米級(jí)的孔隙和纖維結(jié)構(gòu)表面的黏附類似于二維表面的細(xì)胞黏附，細(xì)胞并非處于真正的三維環(huán)境下（由于材料孔隙和纖維尺寸與細(xì)胞尺寸為同一數(shù)量級(jí)），而納米級(jí)的纖維結(jié)構(gòu)能夠提供更多的細(xì)胞黏附點(diǎn)位，更接近細(xì)胞真實(shí)的三維微環(huán)境（見下圖1.1）。

圖1.1 細(xì)胞在微米級(jí)孔隙、微米級(jí)纖維支架和納米纖維支架上的黏附

     以往的研究表明，支架結(jié)構(gòu)對細(xì)胞功能的影響是多尺度的，從納米尺度、微米尺度到宏觀孔隙結(jié)構(gòu)均有重要影響。而支架的多尺度結(jié)構(gòu)特征則有賴于所使用的制造技術(shù)，而生物制造則是一門致力于將生物材料（包括細(xì)胞）采用制造學(xué)的手段加工成為能夠滿足組織工程應(yīng)用的特定三維結(jié)構(gòu)的一門交叉學(xué)科。因此，組織工程的目標(biāo)是制造修復(fù)病理或受損組織的替代物，而生物制造則為組織工程提供了豐富的制造和加工手段。

人體天然組織器官特征與生物制造技術(shù)概述

天然組織器官結(jié)構(gòu)特征

   通過對天然組織器官的解剖，可以發(fā)現(xiàn)天然組織呈現(xiàn)極其復(fù)雜的分級(jí)結(jié)構(gòu)特征，其特點(diǎn)如下：

在納米和亞微米尺度（10nm~1000nm）范圍，具有成分復(fù)雜且呈現(xiàn)納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)，前面已經(jīng)提及，不再贅述；

在微米尺度（1μm~100μm）范圍，廣泛分布于組織內(nèi)的毛細(xì)血管及微血管網(wǎng)絡(luò)則處于該尺度范圍內(nèi)，對細(xì)胞的存活、氧氣營養(yǎng)供應(yīng)和物質(zhì)代謝具有極其重要的意義，而構(gòu)成生命的基本單元細(xì)胞的尺寸也在該尺度范圍內(nèi)；

在100μm~mm尺度范圍，構(gòu)成人體器官的基本結(jié)構(gòu)單元?jiǎng)t處于該尺度范圍，如肺的肺泡，其直徑為0.2mm，成人有3億~4億個(gè)肺泡；腎臟的腎單位，每側(cè)腎由100萬~150萬個(gè)腎單位構(gòu)成；此外還有肝臟的肝腺泡等，而這些功能單元對器官的生理功能起著決定性作用。此外，構(gòu)成血管網(wǎng)絡(luò)的小血管也在該尺度范圍內(nèi)；

在mm~cm尺度范圍，組織器官的外部尺寸、中尺寸和大尺寸的血管均是處于該尺度范圍內(nèi)。

任一復(fù)雜組織器官都包含以上多種不同尺度的結(jié)構(gòu)特征，除此之外，組織器官往往是由多種不同類型的細(xì)胞以有序的空間排列而構(gòu)成。

     總而言之，特定的多種細(xì)胞有序排列、復(fù)雜的分級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)、多尺度的組織結(jié)構(gòu)特征、復(fù)雜的功能亞單元和復(fù)雜的組織器官外形都使得人工組織器官的構(gòu)建面臨極大的困難。

生物制造技術(shù)概述

     目前，生物制造技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)能夠部分解決前述挑戰(zhàn)中的問題，尤其是隨著納米生物制造技術(shù)和生物三維打印技術(shù)等新興制造技術(shù)的出現(xiàn)，復(fù)雜組織器官的人工構(gòu)建已經(jīng)不再遙不可及。

     隨著生物制造技術(shù)的發(fā)展和人們對于組織發(fā)育、傷口愈合等過程的了解越來越深入，形成了兩類的組織工程路線，即：

基于支架的組織工程路線（scaffold-basedtissue engineering）——前面已提及組織工程對支架的要求，該技術(shù)路線的核心是制造理想的支架，這種支架能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，并向組織器官發(fā)育，為人工組織器官的構(gòu)建提供良好的外部環(huán)境。為此，支架的制造成為生物制造研究的重要方向之一，目前誕生了從納米尺度、微米尺度再到宏觀尺度的一大類支架制造技術(shù)，極大地推進(jìn)了組織工程的研究進(jìn)展。然而，迄今為止，該技術(shù)路線在構(gòu)建復(fù)雜組織器官方面仍未取得突破。困難在于，種植在支架內(nèi)的細(xì)胞密度不足，且分布難于控制，細(xì)胞能否自行遷移、聚集并向組織器官發(fā)育完全依賴于細(xì)胞-支架材料和細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用以及細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所提供的微環(huán)境，然而究竟如何構(gòu)建這種環(huán)境目前尚無定論。

    無支架組織工程技術(shù)路線（scaffold-freetissue engineering）——該技術(shù)路線是受發(fā)育生物學(xué)的啟發(fā)，人體胚胎在發(fā)育過程中，無需任何支架，即可形成各種組織器官。因此，在體外構(gòu)建人工組織器官時(shí)，支架并非必須的。如果可以直接操縱細(xì)胞或細(xì)胞簇，將其精確沉積定位排列成為可以模擬人體天然組織器官的三維結(jié)構(gòu)，則對于形成多種細(xì)胞的有序結(jié)構(gòu)具有重要意義。所謂無支架組織工程就是不使用任何可降解的聚合物支架，直接利用細(xì)胞或細(xì)胞-生物材料單元構(gòu)建人工組織器官的方法。典型的方法如細(xì)胞打印是直接將細(xì)胞單元打印成為三維結(jié)構(gòu)。

   下面將分別論述針對應(yīng)用于兩種技術(shù)路線的生物制造技術(shù)。

基于支架技術(shù)路線的生物制造技術(shù)
納米生物制造技術(shù)

   納米生物制造技術(shù)的出現(xiàn)為仿生地構(gòu)建具有類似細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提供了可能。目前，制造納米纖維網(wǎng)絡(luò)支架的技術(shù)包括電紡絲技術(shù)、熱致相分離技術(shù)和分子自組裝技術(shù)。

（1）電紡絲技術(shù)

   電紡絲技術(shù)是利用高壓靜電場的作用將生物材料溶液或熔體進(jìn)行紡絲加工的技術(shù)（如下圖1.2所示），生物材料微滴在電場力和表面張力的共同作用下形成“泰勒錐”，噴射流被迅速拉細(xì)，且溶劑快速揮發(fā)，最終在收集裝置（平板或旋轉(zhuǎn)收集裝置）上形成納米纖維網(wǎng)絡(luò)。

圖1.2 電紡絲技術(shù)原理

   電紡絲技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其紡絲裝置簡易、成本低，而且材料適用范圍非常廣泛，凡是可以制備成溶液的合成高分子材料和天然生物材料均可以用電紡絲進(jìn)行加工，是目前制備納米纖維支架研究最多的技術(shù)。此外，電紡絲還可制備具有特殊結(jié)構(gòu)的支架，如纖維定向排列、多材料多層復(fù)合結(jié)構(gòu)、同心多材料復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)等，因此電紡絲工藝具有極高的靈活性。然而，其不足在于，其所沉積的納米纖維直徑比天然外基質(zhì)中的纖維直徑大，普遍在50nm以上；另外沉積的納米纖維支架缺乏宏觀孔隙，因此細(xì)胞難以長入到支架內(nèi)部；此外可能存在的有機(jī)溶劑殘留也可能對細(xì)胞生長不利。目前，電紡絲技術(shù)一般用于薄膜類或管狀支架的制造，三維支架的制造仍然比較困難。

（2）分子自組裝技術(shù)

分子自組裝技術(shù)是分子在不受外力的作用下分子自行聚集、組織形成規(guī)則結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，是自然界中普遍存在的現(xiàn)象。分子自組裝主要是利用分子與分子或分子中某一片段與另一片段之間的分子識(shí)別，通過非共價(jià)鍵，如氫鍵、范德華力、π-π堆積以及親水疏水等形成具有特定排列順序的分子聚集體，是目前化學(xué)方向的前沿。在組織工程應(yīng)用方面，研究最多的是兩親性（親水疏水）多肽的自組裝，多肽具有很好的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)能力，且能夠自組裝成為納米纖維結(jié)構(gòu)，形成的納米纖維直徑最低可至10nm，能夠較好地模擬外基質(zhì)的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。此外，還可以在多肽中包含特定的功能性基序（如RGD序列，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列）以增加細(xì)胞的黏附。但這種方法涉及復(fù)雜的化學(xué)效應(yīng)，且對纖維結(jié)構(gòu)控制上的靈活性遠(yuǎn)遜于電紡絲技術(shù)。

（3）熱致相分離技術(shù)

熱致相分離也可以用于納米纖維支架的制造，聚合物材料如PLLA等溶于有機(jī)溶劑后，降至低溫時(shí)會(huì)發(fā)生熱力學(xué)不穩(wěn)定，從而分離成為兩相：富聚合物相和窮聚合物相，通過冷凍干燥，溶劑相升華去除后，便獲得僅由聚合物構(gòu)成的納米纖維支架。納米纖維直徑受到熱致相分離過程中操作參數(shù)的影響，如聚合物溶液濃度和冷凍溫度等。該方法是制備納米纖維支架的簡便方法，但其僅適合于結(jié)晶聚合物，同樣對納米纖維結(jié)構(gòu)控制上的靈活性也不及電紡絲工藝。

     上述提到的電紡絲、分子自組裝和熱致相分離都是用于制造納米纖維基質(zhì)，上述技術(shù)在模擬人體天然外基質(zhì)方面已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展，而納米生物制造的另外一個(gè)重要的研究方向是材料表面二維納米形貌的制造。

（4）納米表面形貌制造技術(shù)

大量的研究表明，支架材料的表面形貌對細(xì)胞功能具有重要的影響。如圖1.3所示的材料表面形貌包括納米溝槽、納米凸起和納米凹陷，可能對細(xì)胞形狀、遷移、增殖和分化等產(chǎn)生重要的影響。比如，多種細(xì)胞在納米溝槽表面會(huì)沿著溝槽方向排列并延伸，而在光滑的材料表面細(xì)胞則呈現(xiàn)圓形。這種效應(yīng)表明，支架表面形貌對于支架設(shè)計(jì)和制造的重要性，將特定的表面納米形貌包含到支架設(shè)計(jì)和制造中，對控制細(xì)胞功能可能具有重要意義。目前，用于制造表面納米形貌的技術(shù)可分為兩類：表面有序結(jié)構(gòu)的制造和表面無序結(jié)構(gòu)的制造。前者的技術(shù)包括：基于光刻或軟光刻的圖形復(fù)制技術(shù)和電子束光刻等；后者的技術(shù)包括：在材料表面用電紡絲等技術(shù)沉積納米纖維和材料表面化學(xué)處理等。

然而，目前面臨的挑戰(zhàn)在于表面形貌的制造目前僅能用于二維基底，在三維支架中制造表面納米形貌仍然非常困難，但將其作為三維支架設(shè)計(jì)的重要考慮因素是未來的發(fā)展方向。

圖1.3 材料表面納米形貌以及細(xì)胞在材料表面的反應(yīng)

微尺度生物制造技術(shù)

      在該尺度范圍內(nèi)，急需解決的問題就是血管化的問題。在人體內(nèi)，氧、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等的交換是靠擴(kuò)散進(jìn)行的，然而擴(kuò)散的有效距離僅為100~ 200μm，厚度大于幾百微米的組織都需要一套血管網(wǎng)來支撐細(xì)胞的生理活動(dòng)。人工組織體外培養(yǎng)時(shí)，可以通過灌流灌注的生物反應(yīng)器為其提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，而當(dāng)植入體內(nèi)后，細(xì)胞必須依靠附近的毛細(xì)血管來提供，因此血管化對人工組織的存活起著關(guān)鍵作用。組織的血管化是靠宿主的血管長入到人工組織實(shí)現(xiàn)的，然而這種方式的問題在于血管化的速率太慢（每天僅幾十微米），這樣就會(huì)導(dǎo)致人工組織內(nèi)的細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致修復(fù)失敗，如何實(shí)現(xiàn)快速血管化已經(jīng)極大地限制了組織工程的發(fā)展。

目前實(shí)現(xiàn)血管化的方法主要包括如下幾種：

Ø 支架設(shè)計(jì)——在支架中設(shè)計(jì)尺寸大于250μm的孔隙，并提高孔隙相互貫通性，從而使得宿主血管能更好地長入植入體，提高血管化的速率，但該方法仍然有賴于宿主血管的長入；

Ø 緩釋促血管化因子——如血管內(nèi)皮生長因子VEGF和成纖維細(xì)胞生子bFGF，可提高血管化速率；

Ø 體外預(yù)血管化——當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞與支架在合適的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，會(huì)形成類血管結(jié)構(gòu)，從而形成預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)，這樣在支架植入體內(nèi)后，無需完全依賴宿主血管的長入來生成血管網(wǎng)，從而加速血管化進(jìn)程；

Ø 體內(nèi)預(yù)血管化——將植入體通過顯微手術(shù)植入到體內(nèi)血供充足的合適部位，利用體內(nèi)生理環(huán)境進(jìn)行預(yù)血管化，初步形成微血管網(wǎng)絡(luò)，然后將植入體取出，再植入到待修復(fù)的部位。

      盡管以上的方法均可加速植入體的血管化進(jìn)程，但都有比較明顯的局限，目前還沒有哪種方法能夠完全解決血管化的問題。

      與此同時(shí)，微制造技術(shù)（microfabrication）由于其可以制造亞微米~微米級(jí)的結(jié)構(gòu)，在制造血管網(wǎng)尤其是模擬毛細(xì)血管網(wǎng)方面體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。

（1） 模型復(fù)制+疊層技術(shù)（replica molding coupled withlamination）

      來源于MEMS技術(shù)的微加工技術(shù)可以用來制造含有毛細(xì)管網(wǎng)的微流體裝置，主要是基于光刻和軟光刻技術(shù)。但傳統(tǒng)的光刻和軟光刻技術(shù)不能直接用于生物微流體裝置的加工，必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。迄今為止，包括PDMS（聚二甲基硅氧烷）、PLGA（乳酸-乙醇酸共聚物）、PCL（聚己內(nèi)酯）、PGS（Poly(glycerol sebacate)）以及天然高分子材料如明膠、海藻酸鈉、絲素蛋白和瓊脂等多種材料已經(jīng)可以被加工成為微流體裝置。所謂的模型復(fù)制就是將光刻的微圖案復(fù)制轉(zhuǎn)移到被加工的材料上的過程。

      圖1.4所示為PLGA微流體裝置的制造過程，通過光刻工藝在硅晶圓表面加工出微結(jié)構(gòu)，然后將PDMS澆鑄在硅模上，從而獲得PDMS模（圖1.4A），然后再將PLGA熔體澆鑄在PDMS模上，PDMS上下模固定在剛性金屬板上，該過程類似于模鍛工藝，在恒定的壓力下壓制，冷卻后即可獲得PLGA微結(jié)構(gòu)（圖1.4B），然后再將含有微管網(wǎng)結(jié)構(gòu)的PLGA材料與光滑的平面PLGA材料通過加熱加壓后結(jié)合在一起，從而形成單層PLGA微流體管網(wǎng)（圖1.4C）。復(fù)雜的微流體網(wǎng)絡(luò)可以根據(jù)人體循環(huán)系統(tǒng)特征和計(jì)算流體結(jié)果，采用MATLAB等軟件設(shè)計(jì)，通過層層疊加即可制造多層微流體裝置。

圖1.4 PLGA微流體裝置的制造過程及微流體裝置

       這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其具有很好的結(jié)構(gòu)分辨率（可至100nm）和設(shè)計(jì)靈活性，在模擬毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)和人體循環(huán)系統(tǒng)流體特性上具有無可比擬的優(yōu)勢，對于體外重建細(xì)胞微環(huán)境有重要意義。該技術(shù)在微流體細(xì)胞培養(yǎng)、生物芯片和藥物研發(fā)等方面具有非常廣泛的應(yīng)用前景。但作為可植入人體的組織工程產(chǎn)品，該技術(shù)仍然面臨很多限制，如三維的微流體裝置必須通過層層疊加制造，因此制造個(gè)性化、外形復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)比較困難，此外，如何將微流體管道與人體循環(huán)系統(tǒng)連接起來也面臨較大困難。

（1） 微立體光刻（microstereolithography, μ-SLA，微光固化）

     在傳統(tǒng)的立體光刻中，液體腔中盛滿液態(tài)的光敏樹脂，在紫外激光照射作用下，液態(tài)樹脂會(huì)發(fā)生交聯(lián)固化，從而由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，在計(jì)算機(jī)的控制下層層掃描制造樹脂零件，該工藝的零件分辨率一般為150μm。所謂微立體光刻是通過改進(jìn)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和光敏樹脂特性，將工藝分辨率提高至低于5μm的水平，而決定工藝分辨率的取決于在紫外激光照射下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的液態(tài)樹脂的體積，因此，必須大幅提高工藝的掃描平面內(nèi)的分辨率和高度方向的分辨率才有可能實(shí)現(xiàn)微光固化。

     光敏樹脂從液態(tài)至固態(tài)的轉(zhuǎn)變存在一個(gè)門檻值（單位體積吸收的光子數(shù)量），該門檻值是由光子吸收速率和輻照時(shí)間決定的，制造過程中單層材料固化的厚度就決定了高度方向的分辨率，為降低固化層的厚度，可以減小輻照的時(shí)間使得更薄的材料固化，但當(dāng)入射激光能量波動(dòng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致工藝穩(wěn)定性很差；而采用高吸收率的反應(yīng)介質(zhì)可有效降低光在樹脂中穿透的深度，從而有效降低固化層厚度。水平分辨率的高則可已通過更好的聚焦系統(tǒng)，減小激光斑點(diǎn)直徑，從而減小固化材料的線寬。

      目前，微立體光刻系統(tǒng)可以分為三類：線掃描式微立體光刻、面投影式微立體光刻和基于雙光子聚合的微立體光刻。尤其是基于雙光子聚合的微立體光刻，其分辨率可至100nm，由于其無可比擬的分辨率，也引起了組織工程研究人員的興趣。如Harvard Univ.的P. Tayalia等人采用雙光子聚合制造了不同孔隙大小和結(jié)構(gòu)的三維支架，用于研究二維和三維支架中細(xì)胞遷移行為的差別。圖1.5為采用微立體光刻技術(shù)制造的組織工程支架。

圖1.5 雙光子聚合工藝制造的微型組織工程支架，a)材料為SR610，b)材料為ORMOCER®, 500×500×300μm3,c)PEG-DA

微立體光刻技術(shù)最大的局限在于其材料體系中必須引入光引發(fā)劑，而往往光引發(fā)劑和液態(tài)單體是有細(xì)胞毒性的，盡管單體聚合后的材料具有較好的生物相容性，但未聚合的液態(tài)單體和光引發(fā)劑的殘留會(huì)對支架的生物相容性造成不利的影響，但微立體光刻作為一種極高成形精度的制造工藝，未來在支架制造方面具有較好的應(yīng)用前景。

（3）壓力驅(qū)動(dòng)微注射沉積（pressure activatedmicrosyringe deposition）

      該工藝最早由Vozzi等人提出，其在不銹鋼注射器的頭部安裝直徑為5μm~20μm的毛細(xì)玻璃針管，材料在過濾的壓縮空氣作用下噴射，該技術(shù)與傳統(tǒng)的基于液體噴射的技術(shù)非常類似，但是由于其安裝的玻璃針管的直徑較小，因此噴出的微絲直徑可達(dá)到10μm以下。但該技術(shù)的問題在于，其僅能噴射粘度較低的生物材料，難于成形粘度較高的生物材料和水凝膠，限制了該工藝的應(yīng)用。

圖1.6 PAM工藝示意圖

生物三維打印技術(shù)（2D/3D Bioprinting）

      三維打印技術(shù)是上世紀(jì)80年代末興起的一種新型制造技術(shù)，最初被稱為快速原型技術(shù)（rapid prototyping），目前學(xué)名為增材制造技術(shù)（additive manufacturing）。三維打印由于其可以直接將所設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)三維模型通過離散堆積的制造原理加工成為實(shí)體模型，具有極高的設(shè)計(jì)和加工靈活性。

   組織工程產(chǎn)品（包括支架）由于其對個(gè)性化要求極高，因此非常適合于用三維打印的方法來進(jìn)行加工。生物三維打印就是采用三維打印的原理將生物材料層層堆積成為三維結(jié)構(gòu)的一類技術(shù)，通過對傳統(tǒng)的三維打印技術(shù)進(jìn)行一定的改進(jìn)即可實(shí)現(xiàn)生物三維打印。

（1） 熔融沉積技術(shù)（fused deposition modeling，F(xiàn)DM）

最初的FDM技術(shù)是將ABS樹脂加熱熔融后擠出（200℃以上），層層打印為三維物體。該技術(shù)的特點(diǎn)為需要將材料制備成絲狀，如圖1.7所示為PCL絲材（熔點(diǎn)為60℃）可以被打印成為三維支架。這種技術(shù)的缺點(diǎn)在于：材料必須為絲材，而往往生物材料為粉末或溶液；此外，加熱熔融可能會(huì)造成某些材料的變性，對生物相容性產(chǎn)生影響。

（2） 光固化成形（stereolithography，SLA）

光固化是最早被研究的三維打印技術(shù)，也是目前所有三維打印工藝中精度最高的一種。然而該工藝僅適用于在紫外光照射下可發(fā)生聚合反應(yīng)的材料，而往往這種材料不具有生物相容性和生物可降解性，為此必須基于現(xiàn)有的生物材料制備合成可光固化的材料體系，與微立體光刻技術(shù)相同，有毒的液態(tài)單體和光引發(fā)劑的殘留會(huì)影響支架的生物相容性。

（3） 選擇性激光燒結(jié)（selective laser sintering，SLS）

該技術(shù)是用激光產(chǎn)生的熱量熔化粉末床上的粉末，層層掃描堆積制造。凡是可以被激光加熱熔融并被制備成為粉末原料的材料均可以用SLS工藝成形，如PCL、PLA、PCL/TCP復(fù)合材料、HA和13-93生物活性玻璃等。該技術(shù)的問題與FDM工藝一樣，材料在高溫下的熔融可能對導(dǎo)致聚合物性能的改變，降低材料的生物相容性。

（4） 三維印刷工藝（three-dimensional printing）

最早的三維印刷工藝是由MIT提出的，其采用噴射的粘接劑使粉末顆粒粘接起來制造三維結(jié)構(gòu)，對生物材料而言，則必須選擇合適的粘接劑，這種粘接劑不能影響支架的生物相容性。

圖1.7 三維打印技術(shù)應(yīng)用于支架制造

     以上的各種工藝均是基于傳統(tǒng)的三維打印工藝改進(jìn)而來，在某些方面均面臨著較大的限制，尤其是材料適用的廣泛性、加工過程對材料的破壞程度等，為此由清華大學(xué)提出的低溫沉積制造技術(shù)則有效地避免了上述問題，成為一種較為理想的支架制造方法。

（1） 低溫沉積制造技術(shù)

     低溫制造的成形原理為生物材料與某種溶劑混合后形成均相溶液，然后通過擠壓噴射的方式噴射至溶劑的凝固點(diǎn)溫度以下，在材料噴射過程中發(fā)生相分離，形成富聚合物相和窮聚合物兩相，溶劑的結(jié)晶可輔助結(jié)構(gòu)的成形。成形完畢后，將制造的支架放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，在低溫真空的環(huán)境下，溶劑升華后留下僅由生物材料構(gòu)成的支架。

該工藝的優(yōu)點(diǎn)在于將熱致相分離技術(shù)與三維打印技術(shù)有效地結(jié)合在一起，既有三維打印技術(shù)的靈活性，又可包含相分離過程形成的微米甚至納米孔隙結(jié)構(gòu)，因此在制造分級(jí)孔隙制造方面具有無可比擬的優(yōu)勢。

     此外，該技術(shù)適用材料范圍廣泛，只要材料能與某種溶劑混合且在低溫下能夠發(fā)生結(jié)晶，且材料在噴射過程中結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞，即可用低溫沉積技術(shù)來制造支架。目前，已經(jīng)探索過的材料體系包括：PLA、PGA、PLGA和有機(jī)1,4二氧六環(huán)體系，明膠、海藻酸鈉、殼聚糖和水體系以及膠原和稀酸溶液體系，在上述溶液體系中還可加入鈣磷鹽粉末制備成為懸液作為原料。因此，低溫沉積制造技術(shù)是組織工程支架較為理想的制造技術(shù)。

圖1.8 低溫沉積制造工藝

      受到材料噴射手段和加工工藝的限制，目前基于三維打印的組織工程支架制造技術(shù)的精度均在100μm以上，因此無法用于制造類似血管網(wǎng)的精細(xì)結(jié)構(gòu)，不斷地提高成形精度仍是有必要的。

傳統(tǒng)的支架制造技術(shù)

     傳統(tǒng)的支架制造技術(shù)包括：溶劑澆鑄+粒子析出法、致孔劑析出法、氣體發(fā)泡法、纖維連接法等，但這些技術(shù)無法控制材料的孔隙大小和相互貫通性，目前的研究已經(jīng)不多。

多尺度支架制造

    前面根據(jù)技術(shù)所處的尺度范圍綜述了各類支架制造技術(shù)，這些技術(shù)均在某一方面具有其它技術(shù)不可替代的優(yōu)勢，因此本質(zhì)上來講這些技術(shù)之間并非替代關(guān)系。理想的支架應(yīng)具備宏觀-微觀-納米多尺度的孔隙結(jié)構(gòu)（macroporous-microporous-nanoporouscombined），這種支架具有個(gè)性化的外形以適應(yīng)組織缺損形狀、可控的貫通宏觀孔隙形狀和大小以適應(yīng)細(xì)胞和血管長入、微觀孔隙以促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)交換和代謝產(chǎn)物排出、納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以模擬人體天然外基質(zhì)，而單獨(dú)一種技術(shù)難以產(chǎn)生所需的結(jié)構(gòu)。因此，未來的趨勢應(yīng)是結(jié)合多種技術(shù)制造具有多尺度結(jié)構(gòu)特征的仿生支架。比如，低溫沉積制造技術(shù)就是將熱致相分離和三維打印技術(shù)相結(jié)合。

面向無支架技術(shù)路線的生物制造技術(shù)

    在基于支架的組織工程技術(shù)路線中，支架是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞向組織轉(zhuǎn)變的橋梁和核心，但基于支架的技術(shù)路線存在細(xì)胞種植密度不足、細(xì)胞在支架內(nèi)的分布無法控制，難以形成天然組織特有的細(xì)胞有序排列等缺點(diǎn)。為此，提出了無支架技術(shù)路線，無支架技術(shù)路線不使用生物材料支架作為細(xì)胞培養(yǎng)的載體，而是直接操縱細(xì)胞，將細(xì)胞看做一種特殊的“材料單元”，采用受控組裝或打印的方法直接將細(xì)胞裝配成為特定的二維或三維結(jié)構(gòu)，然后利用細(xì)胞所具有的自組裝行為，實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞向組織的發(fā)育。目前，根據(jù)所操縱的細(xì)胞單元類型，已經(jīng)被探討的方法可以劃分為（圖1.9所示）：

Ø 單細(xì)胞作為裝配單元（single cells as building blocks）

Ø 細(xì)胞微滴作為裝配單元（microdroplets of cells as building blocks）

Ø 細(xì)胞微組織作為裝配單元（multicellular microtissue as building blocks）

Ø 細(xì)胞-水凝膠微絲作為裝配單元（cell-ladenhydrogels as builing blocks）

Ø 細(xì)胞二維層片作為裝配單元（2D cell sheets as building blocks）

圖1.9 無支架組織工程技術(shù)路線，a) 單細(xì)胞作為裝配單元，b) 細(xì)胞微滴作為裝配單元，c) 組織微球作為裝配單元，d) 細(xì)胞-水凝膠微絲作為裝配單元，e) 二維細(xì)胞層片作為裝配單元

單細(xì)胞作為裝配單元

        單細(xì)胞的精確定位沉積對于形成精確的細(xì)胞排列來模擬人體天然組織的有序結(jié)構(gòu)很有意義。目前，可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞排列的技術(shù)包括：激光導(dǎo)引直寫技術(shù)（laser-guided direct writing of cells）和單細(xì)胞打印技術(shù)（single cell printing）。

     激光導(dǎo)引直寫技術(shù)是DavidJ. Odde等人于2000年提出，其利用弱聚焦的激光（波長約為800nm）捕獲并利用光學(xué)力搬運(yùn)細(xì)胞將細(xì)胞導(dǎo)引至接收基底上的技術(shù)，該技術(shù)具有極高的分辨率，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的精確定位沉積以制造細(xì)胞平面陣列，但其缺點(diǎn)在于導(dǎo)引距離小，效率低（每小時(shí)僅導(dǎo)引幾十~幾百個(gè)細(xì)胞），難于形成三維結(jié)構(gòu)，在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用有限。

     單細(xì)胞打印技術(shù)是基于目前的噴墨打印技術(shù)改造而來。2010年，德國Freiburg大學(xué)聯(lián)合其它六家歐洲研究機(jī)構(gòu)發(fā)起了一項(xiàng)單細(xì)胞打印技術(shù)的研究，由歐共體資助300萬歐元，該項(xiàng)目命名為PASCA（platform for andvanced single cellmanipulation and analysis）。該項(xiàng)目研發(fā)了一臺(tái)單細(xì)胞打印機(jī)，其基于微流體芯片利用流體聚焦原理，并利用壓電晶體噴射實(shí)現(xiàn)微滴的離散打印，在打印過程中利用光學(xué)檢測手段判斷噴射的微滴中是否僅含有單個(gè)細(xì)胞，若不含細(xì)胞或多于一個(gè)細(xì)胞則該微滴不被打印至基底上。事實(shí)上，這種方式并非完全可靠，被打印的微滴中可能不含細(xì)胞，也可能多于一個(gè)細(xì)胞，但總體而言，根據(jù)其報(bào)道的數(shù)據(jù)，含單細(xì)胞的微滴比例為80%左右。與激光導(dǎo)引直寫技術(shù)相比，單細(xì)胞打印的效率大大提高，非常適合于打印二維細(xì)胞陣列。

     總體來講，用單細(xì)胞作為裝配單元，近期的研究目標(biāo)以二維細(xì)胞陣列結(jié)構(gòu)為主，用于細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、疾病診斷或藥物測試領(lǐng)域，用于構(gòu)建三維組織仍然非常困難。一般用于修復(fù)的人工組織包含的細(xì)胞至少上千萬，時(shí)間成本也難以承受。

細(xì)胞微滴作為裝配單元

     所謂細(xì)胞微滴是指包含在微滴中的細(xì)胞數(shù)量多于一個(gè)，往往為3~10個(gè)，打印的細(xì)胞微滴尺寸為數(shù)十微米~一百微米，這樣打印的效率有所提高，但打印精度隨之降低。目前實(shí)現(xiàn)細(xì)胞微滴打印的技術(shù)主要有三種：細(xì)胞微滴噴墨打印、激光打印和微閥打印技術(shù)。

通過改造商用的噴墨打印機(jī)，Boland等人將細(xì)胞懸液代替墨滴，成功地將細(xì)胞打印至水凝膠基底，并保證細(xì)胞有一定的存活率。激光打印技術(shù)是利用入射激光的熱作用使得材料微滴從打印層轉(zhuǎn)移到基底上，而微閥打印是利用微電磁閥的開關(guān)形成打印微滴。上述幾種方法的共同特征在于微滴的細(xì)胞數(shù)量是無法控制的，取決于打印速率和細(xì)胞懸液內(nèi)的細(xì)胞密度等參數(shù)。

   與單細(xì)胞打印相同，如何將離散的微滴組裝成為三維結(jié)構(gòu)以制造人工組織仍然是這些技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)。

細(xì)胞微組織作為裝配單元

      這種細(xì)胞微組織實(shí)際上是細(xì)胞團(tuán)簇，可以包含一種或多種細(xì)胞類型，一般為球狀或圓柱狀，可以用離心法從細(xì)胞懸液制備，直徑一般為幾百微米，制備的微組織作為原料，用生物三維技術(shù)將其打印在水凝膠基底上，按照特定的三維結(jié)構(gòu)排列起來，此后這些微組織會(huì)融合為一體，從而形成宏觀組織。目前，這種技術(shù)已經(jīng)用于血管的制造，主要由Univ. of Missouri的Gabor Forgacs等人提出，目前已經(jīng)成立了器官打印公司organovo致力于將該技術(shù)產(chǎn)業(yè)化。

細(xì)胞-水凝膠微絲作為裝配單元

        該技術(shù)是將細(xì)胞與外基質(zhì)材料連續(xù)擠出，形成微絲單元，利用三維打印的技術(shù)層層堆積加工成為細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體。由清華大學(xué)提出的細(xì)胞三維受控組裝便是屬于此類技術(shù)，該技術(shù)非常適合于構(gòu)建大尺寸的宏觀三維組織，而且不存在前述微組織后續(xù)的融合過程，但該技術(shù)目前所噴出的微絲直徑在200μm以上，難以模擬精細(xì)的組織結(jié)構(gòu)如毛細(xì)血管網(wǎng)。

圖1.10 細(xì)胞三維受控組裝技術(shù)

細(xì)胞層片作為裝配單元

     該技術(shù)的關(guān)鍵在于如何獲得由細(xì)胞和外基質(zhì)構(gòu)成的二維層片。最早Auger等人將人體血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別在加入了抗壞血酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞在抗壞血酸的環(huán)境下會(huì)大量地進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)的內(nèi)源性合成，30天之后即可獲得一層由細(xì)胞和細(xì)胞所分泌的外基質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞層片，然后該層片裹在圓柱狀的支撐上，即可獲得管狀結(jié)構(gòu)。

     Teruo Okano等人在細(xì)胞培養(yǎng)皿表面添加一層N-異丙基丙烯酰胺單體，培養(yǎng)皿表面經(jīng)電子束照射后會(huì)以共價(jià)交聯(lián)的方式固定在培養(yǎng)皿表面，這種材料在溫度變化的作用下發(fā)生親水/疏水性轉(zhuǎn)變，當(dāng)溫度低于32℃時(shí)，培養(yǎng)表面呈現(xiàn)親水性，當(dāng)溫度高于32℃時(shí)，培養(yǎng)表面則會(huì)變?yōu)槭杷�性。首先�?7℃下培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞貼附在培養(yǎng)表面并增殖形成一層細(xì)胞層片，然后降溫至20℃，細(xì)胞層片則會(huì)與培養(yǎng)表面分離，從而獲得細(xì)胞層片。細(xì)胞層片可以直接用于移植，特別適合于薄膜類組織，未來如何操縱二維的細(xì)胞層片來制造包含血管網(wǎng)的復(fù)雜三維組織仍需進(jìn)一步研究。

裝配單元類型選擇與對比

       前面論述了利用細(xì)胞或細(xì)胞-材料單元構(gòu)建二維或三維結(jié)構(gòu)的方法，裝配單元類型的選擇主要從裝配精度、效率、制造三維結(jié)構(gòu)難易程度以及多種類型細(xì)胞受控排列難易程度等加以考慮（如表1.1所示）。不難看出，單細(xì)胞裝配具有最高的精度，但裝配效率低且難以制造三維結(jié)構(gòu)；細(xì)胞微滴裝配精度有所降低，效率有所提高，仍難以制造三維結(jié)構(gòu)；微組織和材料微絲單元具有較高的裝配效率，且易于構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)，但精度較低；二維細(xì)胞層片也具有較高的效率，但較難于制造三維結(jié)構(gòu)。

表1.1 裝配單元類型比較

單元類型	精度	效率	制造三維結(jié)構(gòu)	多類型細(xì)胞的受控排列
單細(xì)胞	5μm	低	困難	較容易
細(xì)胞微滴	10~100μm	較低	困難	較容易
微組織	100~500μm	較高	較容易	較容易
細(xì)胞-材料微絲	200~500μm	高	容易	較容易
二維細(xì)胞層片	層片厚80μm	高	較困難	較困難

      此外，還需考慮的一個(gè)重要問題是：由細(xì)胞或細(xì)胞-材料單元裝配后的結(jié)構(gòu)在體外培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會(huì)遷移、增殖和分化，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞自身的生理活動(dòng)如何影響裝配后的結(jié)構(gòu)？細(xì)胞對結(jié)構(gòu)的重塑（remodeling）會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞重新排列分布，從而喪失了原有裝配過程中細(xì)胞所具有的定位精度，因此初始裝配精度的效果和必要性必然會(huì)因此而大打折扣。

     事實(shí)上，該過程是細(xì)胞的受控組裝與細(xì)胞自組裝相結(jié)合的一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程，初始的細(xì)胞精確裝配可能并非是必要的，而了解裝配后細(xì)胞的遷移、聚集及自組裝的機(jī)理和轉(zhuǎn)變過程更為必要�？梢赃@樣說，受控組裝為細(xì)胞或多種細(xì)胞提供了一個(gè)結(jié)構(gòu)的初始狀態(tài)，在體外培養(yǎng)下，最終狀態(tài)如何則取決于細(xì)胞的自身行為。

    在以上假設(shè)基礎(chǔ)上，可以降低對精度的要求，從而轉(zhuǎn)向效率更高的裝配方式，其中適合于用三維打印技術(shù)來裝配的單元包括：微組織和細(xì)胞-材料微絲單元，本論文采用了細(xì)胞-材料微絲單元來構(gòu)建三維組織。

生物制造技術(shù)小結(jié)   


綜述了目前常見的各種生物制造技術(shù)，根據(jù)基于支架技術(shù)路線和無支架技術(shù)路線，對各種技術(shù)進(jìn)行了分類，并根據(jù)技術(shù)所處的制造尺度分析了相應(yīng)的技術(shù)特。

生物3D打印技術(shù)深入解讀之一http://m.lhkhtyz.com/thread-43724-1-1.html
生物3D打印技術(shù)深入解讀之二http://m.lhkhtyz.com/thread-43797-1-1.html
生物3D打印技術(shù)深入解讀之三http://m.lhkhtyz.com/thread-43870-1-1.html

看看吧